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Bioquímica

Avanço no estudo de peptídios

Trabalho de grupo brasileiro é reconhecido internacionalmente

Três pesquisadores brasileiros ganharam destaque mundial num setor estratégico da bioquímica de hoje: desenvolveram técnicas para analisar com mais eficiência a estrutura molecular de proteínas e peptídios (compostos de aminoácidos formados sinteticamente ou por hidrólise de proteínas). Suas descobertas, iniciadas na década de 80, foram relatadas na edição de 29 de maio último da prestigiada revista Chemical e Engineering News (páginas 54-59), da American Chemical Society.

O trabalho de Clóvis Nakaie, chefe do Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), Shirley Schreier, do Departamento de Bioquímica da Universidade de São Paulo (USP), e Antônio Cechelli de Mattos Paiva, professor de Biofísica da Unifesp, facilita o estudo da conformação molecular de proteínas e peptídios, bem como da interação desses compostos entre si e com membranas celulares. Os resultados têm muitas aplicações, entre elas a possível criação de drogas terapêuticas.

Oobjetivo era aperfeiçoar o método que usa marcadores de spin (direção do eixo de rotação do elétron). Inseridos numa molécula, esses marcadores (spin labels) permitem obter dados sobre a conformação dela e suas interações, por meio da técnica de espectroscopia por ressonância paramagnética eletrônica (RPE). É um estudo difícil, demorado e caro, sobretudo pela complexidade dos peptídios, que são formados por uma cadeia de aminoácidos. Cada aminoácido tem uma cadeia lateral (r), que fica pendente da cadeia principal do peptídio.

O método convencional por RPE era ligar numa cadeia r algum marcador, para obter um sinal no aparelho. Mas, dessa forma, o marcador ficava longe da cadeia principal, objeto maior do estudo, e as informações eram mascaradas pela alta mobilidade das cadeias laterais, dificultando a obtenção de dados precisos.

Novo marcador
A grande contribuição do grupo foi usar um marcador de spin que pode ser ligado à cadeia principal. O marcador é o TOAC (ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil-4-amino-4-carboxílico), única molécula conhecida que é ao mesmo tempo um aminoácido e um radical livre bem estável. Como aminoácido, pode ser introduzido em peptídios, proteínas e outras macromoléculas, e o fato de conter um radical nitróxido permite que funcione como marcador de spin.

Sendo um composto paramagnético (por ter um elétron desemparelhado), o TOAC permite a espectroscopia de RPE para estudar as propriedades estruturais e dinâmicas do marcador isolado e da molécula à qual está acoplado, bem como os efeitos de alterações do meio onde está a molécula.

Com espectros de RPE se pode, por exemplo, observar alterações conformacionais quando um composto se liga a uma membrana biológica ou modelo. Assim, a ligação de um marcador de spin permite obter dados sobre o grau e a natureza da movimentação, da conformação e da estruturação da molécula ou do sistema investigado.

Desafio superado
O TOAC tem a vantagem de ser aminoácido e a desvantagem de ser radical livre – portanto, passível de degradação química, conforme o meio em que esteja. Esse era o grande desafio quando se pensou em ligá-lo a cadeias peptídicas pela metodologia de síntese e química de peptídios, já dominada pelo grupo.

Paiva, especialista em química de peptídios, e Shirley, em cujo laboratório se usa muito a técnica RPE, discutiram o problema, com a participação do então pós-graduando Nakaie. Das discussões, e de resultados iniciais promissores, surgiu a técnica que permitiu incorporar o TOAC à cadeia peptídica e estudar as propriedades conformacionais do peptídio, desenvolvida em 1980 na tese de doutoramento de Nakaie.

O avanço de Nakaie consistiu em encontrar uma seqüência de procedimentos (ou protocolos) de pesquisa química, que permitiu ligar o TOAC à ponta de um peptídio. Devido à sua estrutura química e à rigidez de sua ligação à cadeia peptídica, esse marcador fornece dados mais precisos sobre a conformação do peptídio do que os obtidos com os spin labels usados até então, em geral ligados só a cadeias laterais dos aminoácidos.

Molécula especial
Paivasalienta: “Desenvolvemos a síntese e a aplicação de uma molécula especial que se incorpora ao peptídio de maneira bem estreita, íntima. Dali para a frente, poderíamos lidar com seqüências peptídicas cuja dinâmica estaria sendo fielmente reportada por um eficiente marcador”.

“Até então”, diz a pesquisadora Shirley, “ninguém tinha comprovado a possibilidade de marcação peptídica com um aminoácido paramagnético como o TOAC. Além do mais, mostramos também que o espectro de RPE do TOAC ou do TOAC-peptídio era afetadopelo pH (índice de acidez), resultante da ionização do grupamento amínico desse marcador de spin. Esse resultado deixava em aberto, portanto, a possibilidade intrigante de que esse marcador ou o peptídio marcado poderiam funcionar como sensores de pH do local onde se encontrassem.”

Depois do doutoramento, Nakaie prosseguiu nessa linha e tem sido responsável pelos principais avanços no desenvolvimento de estratégias de síntese, marcação e uso de peptídios marcados com TOAC e derivados nos últimos anos.

Estratégia incomum
“Vencido o primeiro desafio”, diz Nakaie, “existia um outro, e mais complexo: sendo o TOAC um aminoácido, deveria idealmente ser possível sua inserção também em posições internas de seqüências peptídicas e não só na ponta. Entretanto, por problemas de instabilidade química no protocolo de síntese empregado, isso não foi viável na época. Na estratégia de síntese necessária para a introdução do marcador no meio da cadeia ocorria uma decomposição irreversível do grupo nitróxido do TOAC, inviabilizando a obtenção dos espectros de RPE.”

Só na década seguinte (em 1993), com os avanços na química de peptídios, Nakaie e seu estudante de pós-graduação Reinaldo Marchetto – hoje docente do Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista em Araraquara – resolveram o problema: combinaram etapas de dois métodos de síntese peptídica, introduziram um tratamento alcalino ao final da síntese e obtiveram assim o primeiro peptídio marcado com TOAC numa posição interna da seqüência (TOAC7-angiotensina II).

Estava vencida a última barreira ao uso de TOAC com um aminoácido qualquer e abria-se a possibilidade de colocá-lo em qualquer posição na cadeia, o que ampliava enormemente sua potencialidade de uso. “Então, mandamos o trabalho a uma importante revista de Química (Journal of American Chemical Society). O artigo foi aceito como uma comunicação para publicação rápida, evidenciando o reconhecimento de sua importância”, comenta Shirley.

Nakaie prosseguiu as pesquisas, com recursos da FAPESP, para melhorar a síntese de peptídios em resinas e verificar, com o TOAC, como essas resinas se comportam em diferentes situações. A marcação pelo TOAC permite acompanhar bem a síntese, que é um trabalho muito caro. O acompanhamento permite, por exemplo, mudar o meio solvente, escolhendo fases em que o sinal do marcador indica maior mobilidade (ou solvatação) do composto, o que melhora os resultados.

Nakaie explica: “Há solventes em que o grão da resina fica ‘empacotado’ e outros em que o grão se ‘solta’ mais, as cadeias ficam mais livres e a reação vai mais veloz, com mais rendimento”. Com a mobilidade maior, a síntese de peptídios fica mais barata. Esses resultados mais recentes foram tema de uma publicação em 1999.

Relevância biológica
Proteínas e peptídios têm grande importância fisiológica. O estudo de suas interações com outros peptídios, proteínas, carboidratos, oligonucleotídeos, anticorpos e variados componentes da membrana celular pode dar informações essenciais, em nível molecular, para entender como hormônios, enzimas e outros compostos agem. Isso pode permitir a criação de novas drogas terapêuticas.

Também se intensificam estudos para relacionar conformação e função biológica de peptídios biologicamente ativos, como os hormônios envolvidos em processos de manutenção da vida ou que influemna causa de doenças. Shirley salienta: “A função fisiológica de um composto é conseqüência de sua estrutura, por isso é que esses estudos são importantes”. É nesse contexto que se salienta a investigação dos pesquisadores, reconhecida no artigo da Chemical e Engineering News, que os descreve como iniciadores de uma linha de investigação também seguida nos últimos 20 anos por outros – em especial os grupos liderados por Claudio Toniolo, da Universidade de Roma (Itália), e por G.L. Millhauser, da Universidade da Califórnia (EUA).

Repercussão
Além de atrair pesquisadores americanos e europeus, o trabalho do grupo, pioneiro na simplificação e no barateamento da síntese de peptídios, repercutiu no setor privado: a Toronto Research Chemicals, do Canadá, investiu em marcadores de spin e iniciou a produção de TOAC.

Os pesquisadores só lamentam não ter patenteado a técnica em 1993, quando publicaram a descoberta no Journal of American Chemical Society. “Na época não se falava em patente por aqui. Era uma coisa que nem passava por nossa cabeça”, revela Nakaie. Nos últimos anos a situação mudou e ele obteve patentes ligadas a etapas recentes do trabalho.

PERFIS
Antônio Cechelli de Mattos Paiva
formou-se médico pela Escola Paulista de Medicina (1952), onde foi professor titular de Biofísica (1966-1998). Também foi titular de Bioquímica no Instituto de Química da USP (1980-1984).
ProjetoRelações entre Estrutura e Atividade de Receptores Acoplados a Proteínas G: Receptores de Peptídios Vasoativos
Investimento : R$ 331.886,26 e US$ 130.840,00

Clóvis Ryuichi Nakaie, formou-se em Ciências Farmacêuticas (1974) e fez doutorado em Bioquímica (1980) na Escola Paulista de Medicina, atual Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Desde 1978 é professor na Unifesp, onde chefia o Departamento de Biofísica.
ProjetoSíntese e Estudos Físico-Químicos de Copolímeros de Estireno como Matrizes de Síntese Peptídica e de Cromatografias Líquidas em Coluna
Investimento : R$ 65.858,45 e US$ 107.779,00

Shirley Schreier graduou-se em Química pela USP (1962), onde também tornou-se professora (1965), doutora (1969) e titular do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química (1990). Foi pesquisadora visitante em vários centros do exterior, notadamente no National Research Council do Canadá, nos anos 70.
ProjetoAnestésicos Locais: Síntese, Propriedades Estruturais e Físico-Químicas e Interação com Membranas Modelo e Biológicas
Investimento : R$ 206.415,79 e US$ 259.048,91

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