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Citología

Los jardines colgantes de las células

El cultivo en ambiente tridimensional permite observar estructuras desconocidas y mejorar la comprensión sobre el desarrollo cerebral

Léo Ramos Chaves Placa para cultivo en 3D frente a estructuras mostradas en el monitor del microscopioLéo Ramos Chaves

Si las células de la nariz poseen la misma información genética que las de los dedos, ¿por qué no sentimos el olor de las páginas de la revista por el mero acto de hojearlas? Con cuestionamientos similares, relacionados con el modo en que las células que poseen el mismo material genético asumen formas y ejecutan funciones tan diferentes, la bioquímica iraní-estadounidense Mina J. Bissell, del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, en Estados Unidos, resolvió “pensar fuera de la célula” hace más de tres décadas. En lugar de estudiar los genes para develar los misterios del cáncer, se concentró en la matriz extracelular, formada por elementos fluidos y fibrosos que suministran las condiciones para el crecimiento y la diferenciación de las células. Tras una serie de descubrimientos que validaron y ampliaron la empresa, Bissell y su equipo obtuvieron imágenes inéditas que confirman la existencia de filamentos de proteínas que conectan directamente el núcleo de la célula con el ambiente extracelular. “Resulta alentador haber visto esto por primera vez”, declaró por teléfono a Pesquisa FAPESP.

La razón de este entusiasmo reside que el descubrimiento de una conexión directa del núcleo con el microambiente de la célula puede derivar en una nueva comprensión acerca de las influencias del medio externo en el comportamiento celular. La caracterización de estas estructuras apareció en enero en la revista Journal of Cell Science.

Situado en la parte interna de las células y, según se creía, aislado físicamente del mundo exterior, el núcleo aloja los genes y se comunica con el organismo por vías químicas: moléculas que atraviesan las barreras de las membranas y llegan al material nuclear o activan cadenas de reacciones químicas que influyen en su funcionamiento.

“Mientras estamos acá conversando, nuestros 70 billones de células entablan un constante diálogo con aquello que las rodea –la matriz extracelular–, intercambiando señales entre el núcleo y el microambiente”, comentó Bissell, en referencia a lo que envuelve a las células en el organismo vivo. Ya se sabía que esta conversación entre el núcleo y la matriz transcurre mediante interacciones entre moléculas, que pueden reprogramar las células o alterar su comportamiento. La novedad reside en la conexión física.

Los científicos –entre ellos el brasileño Alexandre Bruni-Cardoso, del Instituto de Química de la Universidad de São Paulo (IQ-USP)– lograron ver esos filamentos porque combinaron distintas técnicas de microscopía de luz y electrónica y más de 15 mil imágenes de diferentes puntos de células mamarias, registrando en detalle el núcleo celular atravesado por túneles. Dentro de éstos, los filamentos de proteínas se extienden hasta la membrana de la célula, anclada en la matriz extracelular. “Estos cables del citoesqueleto conectan la parte externa de la célula con el núcleo”, dice Bruni-Cardoso, quien en 2014 culminó una pasantía de posdoctorado en el laboratorio de Bissell.

Para caracterizar detalladamente a los filamentos, también echaron mano de una técnica aún poco explotada, pero que permite investigar las relaciones de la célula con el medio que la rodea: el cultivo tridimensional (en 3D) de células.

Una coneción directa
En una placa de Petri, aquel recipiente achatado que se utiliza para realizar los cultivos de microorganismos y de células, puede que el científico no logre avanzar en el cultivo de las células mucho más allá de su proliferación. Sucede que, en esa estructura bidimensional, éstas forman una capa plana como la propia placa, algo significativamente distinto a lo que ocurre en el organismo. “La vida es en 3D y también lo es la biología. Para reproducir la arquitectura de las células, cuya importancia se vuelve aún más evidente frente al descubrimiento de que existen conexiones físicas entre la información genética existente en el núcleo celular y el microambiente, se necesita más”, afirma Bruni-Cardoso.

Esta conexión de proteínas que forman filamentos y unen la parte exterior de la célula con su interior ya había sido propuesta por Bissell en la década de 1980, cuando acuñó el concepto de “reciprocidad dinámica”: la célula recibe el influjo de señales externas y, a su vez, afecta al medio que se encuentra a su alrededor. La investigadora, una de las pioneras en el cultivo de células en 3D, sostenía que la forma que adquiere el tejido (su arquitectura) también constituye una fuente de información y es un componente del microambiente.

En la investigación que realizó en colaboración con Bissell, Bruni-Cardoso trabajó con células de la glándula mamaria humana en cultivo en 3D. En lugar de estar dispuestas sobre una placa, las mismas crecen dentro de un gel rico en laminina, una molécula de adherencia celular presente en el microambiente del organismo vivo. Al estar suspendidas y envueltas en estructuras que mimetizan el microambiente celular, las células son capaces de dividirse, organizándose en una estructura que se asemeja mucho a los ácinos, las unidades funcionales de las glándulas mamarias encargadas de la producción de leche durante la lactancia.

Al observar lo que sucede dentro de ese gel, ocupado por células organizadas similares a las del tejido vivo, los investigadores pretenden comprender el rol de los filamentos en las interacciones entre el núcleo celular y el microambiente.

El cultivo en 3D debe mucho a los trabajos que precedieron al descubrimiento de los filamentos en el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley. A mediados de la década de 1980, Mina Bissell logró que células mamarias en cultivo se diferenciasen y produjesen leche. “Observamos el funcionamiento de la glándula mamaria, y toda la armonía que existe entre la forma y la función, y entonces pensamos: ¡Que estructura hermosa! ¿Cómo se organizan las células de esa forma para producir leche y hacer que la misma llegue hasta los pezones, de donde el bebé la succionará?”, recordó.

Alexandre Bruni-Cardoso/ USP Estructura mamaria in vitro vista mediante microscopía de fluorescenciaAlexandre Bruni-Cardoso/ USP

Los investigadores entonces documentaron con un microscopio electrónico la glándula mamaria de una hembra de ratón al comienzo de la gestación. Estaba todo allí: durante la lactancia, la leche es producida por las células de los alvéolos y se acumula en las cavidades de esas estructuras y dentro de los conductos galactóforos: toda una arquitectura abocada a la producción y la distribución de esa secreción nutritiva.

Bissell y su equipo intentaron cultivar las células de la glándula mamaria en placas de Petri. Depositadas sobre la superficie plana, son incapaces de asumir la morfología observada in vivo, e incluso cuando reciben las hormonas que inducen la producción de leche, en tres días pierden la función. La investigadora experimentó entonces el cultivo de las células en un material viscoso que impedía su contacto con la superficie. Para lograrlo, le añadió al cultivo aquello que había observado en las fotografías y que, hasta ese momento, se creía que era tan sólo un soporte de la estructura celular: la matriz. “En aproximadamente cuatro días pudimos repetir la muletilla de una propaganda gubernamental entonces famosa en Estados Unidos: “Yes, we have milk’ [sí, tenemos leche].”

Dimensiones in vitro
Punto a favor de la tridimensionalidad del ambiente donde se cultivaron las células. “Al observar la histología de la glándula mamaria se ve claramente que hay muchas cosas del lado de afuera y que la matriz extracelular comprende una buena parte del órgano”, dice Bruni-Cardoso. En un cultivo bidimensional, prácticamente el 50% de la superficie de la célula se encuentra en contacto con el plástico o el vidrio de la placa de Petri y la otra mitad lo está con el medio de cultivo, que es el líquido con los nutrientes y todos los elementos que necesita para proliferar y permanecer viva. “En tanto, en el modelo en 3D, la mayor parte de la superficie de una célula está en contacto con otras células y con la matriz”, explica el investigador.

La búsqueda de modelos que simulen de manera más aproximada la situación in vivo fue lo que llevó al desarrollo de organoides obtenidos con base en células reprogramadas de pacientes con distintos trastornos cerebrales. Las investigaciones con los llamados minicerebros creados en laboratorio, también suspendidos en una matriz rica en laminina, estimularon una serie de avances en la comprensión de distintos aspectos del funcionamiento del cerebro humano, entre ellos, la reciente descripción minuciosa de la composición química y de la distribución de micronutrientes y minerales durante el desarrollo fetal. Este trabajo, publicado en febrero en la revista PeerJ, se realizó en el Instituto D’Or de Pesquisa e Ensino (Idor) en colaboración con los institutos de Ciencias Biomédicas y de Física de la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ) y con el Laboratorio Nacional de Luz Sincrotrón (LNLS), en Campinas.

Antes, los minicerebros cobraron relieve por haber aportado a la comprensión de la relación entre la infección por el virus del Zika y la microcefalia (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 252). Científicos del Idor y de la UFRJ infectaron esas estructuras con el virus y verificaron que el mismo fue capaz de infectar y matar células madre neuronales, provocando alteraciones drásticas en el desarrollo de los organoides cerebrales y comprobando la relación directa entre la infección y la malformación.

Hasta el momento del cultivo de los minicerebros, la investigación de nutrientes cerebrales se hacía en tejido cerebral humano post mortem. Con los cultivos en 3D de los organoides cerebrales mimetizando diferentes estadios de la formación del cerebro, fue posible comprender la dinámica de los nutrientes durante el desarrollo neurológico. Los resultados muestran que la concentración y la distribución de micronutrientes están directamente relacionadas con el estadio de desarrollo. Los autores las describieron en dos momentos distintos: en uno inicial, de intensa proliferación celular, durante los primeros 30 días, y en un segundo momento, cuando las células comienzan a convertirse en neuronas y se organizan en capas (al 45º día).

Ana Zen/ USP, en microscopio de superresolución Leica TCS SP8 STED3X Filamentos (en verde) atraviesan la célula y conectan el núcleo (en azul) con la matriz extracelularAna Zen/ USP, en microscopio de superresolución Leica TCS SP8 STED3X

“Se trata de un ejemplo de organización tridimensional que sólo se observa en el tejido humano, y en ningún otro tipo de cultivo que no sea el organoide”, dice Stevens Rehen, investigador del Instituto de Ciencias Biomédicas de la UFRJ y del Idor. La combinación de ese modelo de cultivo con la radiación sincrotrón, que permite describir micronutrientes hasta los átomos que los componen, permitió comprender en profundidad importantes aspectos del desarrollo y caracterizar mejor el proceso de formación de esos  organoides cerebrales, ya que los mismos poseen conexiones que obedecen a la anatomía natural.

Los nutrientes que observaron los investigadores son esenciales para la formación adecuada del cerebro. La falta de algunos de ellos durante el desarrollo prenatal está relacionada con déficits de memoria y trastornos psiquiátricos tales como la esquizofrenia. De acuerdo con Rehen, el objetivo actual es utilizar los minicerebros para entender su dinámica en casos de trastornos cuyas alteraciones de nutrientes ya se han descrito.

Para Mina Bissell, se trata de un mundo nuevo por conocer. “Secuenciamos el genoma humano, sabemos mucho sobre los genes, sobre su lenguaje y su alfabeto, pero aún conocemos muy poco o nada de la forma, a no ser que la forma y la función interactúan de manera dinámica y recíproca. Una no prescinde de la otra y los científicos no podemos considerar una sin la otra.”

La investigadora hace mención a un poema del irlandés Willian Butler Yeats (1865-1939) para ilustrar el razonamiento que la llevó a establecer este método importante para la comprensión de la vida en su unidad más elemental. “Oh, cuerpo mecido a música / Oh, vislumbre cautivante/ ¿Cómo separar la danza del danzante?”, dice el poema. “Mientras que un bailarín danza, es bailarín y es la propia danza; en el instante que para, no hay ninguno de los dos. Así sucede con la forma y la función. Así es la vida desde su porción más básica.”

Artículos científicos
JORGENS, D. M. et al. Deep nuclear invaginations are linked to cytoskeletal filaments – integrated bioimaging of epithelial cells in 3D culture. Journal of Cell Science. v. 130, n. 1, p. 177-89. 1º ene. 2017.
SARTORE, R. C. et al. Trace elements during primordial plexiform network formation in human cerebral organoids. PeerJ. 8 feb. 2017.