O ambiente propiciado pelo Programa Genoma-FAPESP está gerando bons e imprevistos frutos. Até agora, dois laboratórios estão se preparando para registrar descobertas ou iniciar metodologias antes impensáveis no Brasil e que surgiram no decorrer do projeto. As pesquisadoras Eliana de Macedo Lemos e Lúcia Carareto Alves, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista (Unesp) de Jaboticabal, que participaram do seqüenciamento do genoma da bactéria Xylella fastidiosa, no âmbito do Projeto Genoma Xylella, já estão preparando uma descrição científica de como elaborar um meio de cultura definido para o crescimento desse microrganismo, com o qual trabalham desde 1994. A FAPESP pretende patentear a descoberta. Simultaneamente, Luís Fernando Reis, do Instituto Ludwig de Pesquisas sobre o Câncer, que participa do Genoma Humano do Câncer, desenvolveu chips de DNA.
Para estudar e chegar ao genoma da Xylella, que está agora com 99,9% dos genes seqüenciados, os pesquisadores do projeto precisam fazer com que a bactéria cresça e se multiplique rapidamente e em grande quantidade. Para conseguir isso, se valem de meios de cultura onde a bactéria possa encontrar todos os nutrientes necessários à sua sobrevivência. No Projeto Genoma Xylella usam-se meios complexos, ou seja, meios cujas fontes de carbono e nitrogênio que os compõem não são definidas. Para o projeto, foram utilizados os meios PW, desenvolvido por M. J. Davis, e o SPW, do norte-americano J.S. Hartung. Os constituintes dos meios PW e o SPW são materiais caros e importados. Com a descoberta de Eliana Lemos e Lúcia Alves os componentes do meio de cultura podem ser comprados aqui mesmo.
Mas as vantagens do meio definido não são só conseguir fazer com que a bactéria cresça e se multiplique. Ele é valioso também para a manipulação genética da Xylella. Com o genoma praticamente fechado, os laboratórios envolvidos no Genoma Funcional pesquisam uma maneira de modificar geneticamente a bactéria, alterando os prováveis genes responsáveis por sua patogenicidade. A idéia é obter mutantes e, para sua seleção, o pesquisador precisa saber exatamente os componentes do meio. Os cientistas ainda não dominam os métodos para a manipulação genética da bactéria, mas ter um meio definido já significa um passo a mais nessa direção.
Como o genoma da bactéria estava quase pronto e a maior parte dos genes estavam anotados, Eliana, bióloga e bioquímica, e Lúcia, bioquímica e microbióloga, analisaram os dados armazenados no Laboratório de Bioinformática do Projeto Genoma Xylella. Sabendo que a maioria dos microrganismos utilizam glicose como fonte de carbono para reações de síntese de moléculas importantes na obtenção de energia, como a ATP, as pesquisadoras analisaram os genes presentes na Xylella, que, descobriram, possuía todas as enzimas necessárias ao metabolismo da glicose e do glicerol, outra fonte de carbono. Portanto, no meio para o crescimento da Xylella poderia ser usado tanto a glicose quanto o glicerol como fonte de carbono.
Voltando ao genoma
Para definir a fonte de nitrogênio do meio, as pesquisadoras analisaram novamente o genoma e observaram quais dos 22 aminoácidos a bactéria conseguia sintetizar. Um deles, o glutamato, era uma exceção. Isso significava que ele deveria estar presente no meio de cultura. Ficou faltando apenas a definição dos sais. Novamente o genoma mostrou que a bactéria tinha os genes relacionados com o transporte dos sais para dentro dela. A membrana da Xylella é seletiva, e a porta de entrada é uma proteína por onde entram ferro, sulfato e magnésio. A análise do genoma também indicou uma elevada quantidade de genes relacionados com a pirofosfatase. Era o que as pesquisadoras precisavam para acrescentar o fosfato, na forma de pirofosfato, ao meio de cultura.
O meio definido de Xylella vai beneficiar pesquisadores do mundo todo e principalmente aqueles envolvidos no Genoma Funcional da Xylella. “Ficou provado que é possível voltar ao genoma e resolver um problema sério”, diz Eliana Lemos. Desde a metade do ano passado, quando chegou à formulação do novo meio de cultura, o laboratório de Jaboticabal faz testes para tornar a bactéria mais competente e possibilitar as modificações genéticas.
Chips de DNA
O primeiro laboratório de chips de DNA, que começa a ser montado no Brasil, irá utilizar seqüências geradas pelo Projeto Genoma Humano do Câncer. Os chips vão organizar as informações geradas pelo projeto e possibilitar aos cientistas responder quando e em quais tecidos um determinado RNA está presente. A iniciativa é do Instituto Ludwig e está sob a responsabilidade do coordenador de RNA do Genoma Humano do Câncer, Luís Fernando Reis . “Eventualmente vamos encontrar genes que estão sendo expressos só no tumor e não no tecido normal e assim descobrir novos alvos para o tratamento ou formas de diagnóstico”, diz Reis.
O novo laboratório deve começar a funcionar em outubro, no prédio do Instituto, que investirá U$ 800 mil no primeiro ano e U$ 400 mil no segundo. A partir daí serão U$ 200 mil anuais para manutenção. Além do coordenador, Reis, outros quatro pesquisadores já estão envolvidos no projeto: Alex Carvalho, Sibele Meireles, Beatriz Stolf e Ludmila Ferreira.
Os chips de DNA ou microarray permitirão a organização dos 500 mil plasmídeos gerados pela técnica Orestes. Plasmídeos são DNA circulares, que se multiplicam nas bactérias de forma autônoma e que carregam um pedaço do DNA de determinada célula. Dentro do Projeto Genoma, para chegar a esse pedaço, os pesquisadores extraem o RNA da célula, que contém os genes expressos. A partir do RNA, que é de difícil manipulação, gera-se o cDNA. Quando são seqüenciados os genes de uma célula de pulmão, por exemplo, está se trabalhando com um pedaço do DNA, o cDNA, introduzido num plasmídeo. Atualmente, chips de DNA são feitos pela comunidade científica com os genes de domínio público disponíveis nos bancos de dados internacionais. O novo laboratório, além de iniciar uma prática pioneira no Brasil, permitirá a descoberta de possíveis novas drogas ou novos marcadores tumorais.
O processo
A base do chip é um suporte sólido, que tanto pode ser uma membrana de náilon ou uma lâmina de vidro. Nela se fixam os plasmídeos com as seqüências correspondentes aos genes expressos nos tecidos normais ou tumorais. Essas seqüências são depositadas no suporte sólido por meio de um robô e, pela utilização de raios ultravioleta, uma reação química fixa as seqüências à membrana. Com os genes assim dispostos e organizados, e comparando-se duas ou mais fases sólidas idênticas, pode-se saber em quais tecidos um determinado gene é expresso.
O microarray também pode indicar quando um gene é expresso: se no tecido normal, na alteração pré-maligna ou na fase maligna. Um robô leva aproximadamente duas horas para produzir cerca de 50 réplicas de uma fase sólida com 10 mil seqüências distribuídas em cerca de 2 centímetros quadrados, no caso de lâminas de vidro, ou cerca de 13 mil seqüências em 70 centímetros quadrados, no caso de suporte de náilon.
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