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Ciencia

Los descubrimientos se multiplican

El recientemente concluido mapeamiento de la Xanthomonas citri inaugura en el país la genómica comparativa, la forma más rápida para el estudio de genes

En vísperas de la Navidad, terminó el secuenciamiento del genoma de la Xanthomonas citri, la bacteria causante del chancro cítrico, un antiguo y grave problema de la citricultura mundial. Por el tiempo en el que se realizó -apenas 14 meses-, ese trabajo muestra la madurez de los métodos de trabajo y del equipo, en buena parte, el mismo que había participado este año del montaje de los genomas de otra bacteria, la Xylella fastidiosa, que provoca el Veteado Cloroso Cítrico (CVC) o plaga amarilla de los naranjos y de la caña de azúcar. El proyecto de la Xanthomonas también inaugura en el país la genómica comparativa: se empieza a poner uno al lado de otro los materiales genéticos de los microorganismos, se descubren cómo los genes actúan y se encuentran medios para reducir las pérdidas agrícolas.

Se encuentra bastante avanzada también la clasificación -o como se viene diciendo, la anotación- de los cerca de 4.500 genes que componen el único cromosoma de la Xanthomonas, el segundo fitopatógeno mapeado en Brasil y uno de los primeros en el mundo. De estos genes, 593 están asociados a procesos metabólicos de producción de energía, 365 a la síntesis de aminoácidos y otras moléculas que colaboran para el funcionamiento de las enzimas, 486 la formación de macromoléculas (proteínas, carbohidratos y lípidos), 310 a procesos celulares (transporte de sustancias, división celular y movilidad) y 292 se relacionan con patogenicidad, virulencia y adaptación de la bacteria. Al final de noviembre había aún 1.530 en la categoría hipotéticos, de función incierta.

Esta etapa final puede terminar en la misma época de la conclusión del montaje del esqueleto básico con las grandes piezas del genoma de otra bacteria, que comenzó a ser mapeado en sepiembre: el de la Xanthomonas campestris, muy semejante al que acaba de conocerse. Los investigadores confían en que, quizás en marzo, ya tendrán detallado el genoma. El grupo maduró. “Esta vez nadie se asustó imaginando si iba a salir bien o no”, comenta João Meidanis,coordinador del Laboratorio Central de Bioinformática de la Universidad Estadual de Campinas (Unicamp), que procesa las informaciones de los laboratorios de secuenciamiento, y desde 1997 sigue a los pioneros de la genómica en Brasil.

Más allá de la confianza, también se ganó tiempo en algunas etapas. La Xylella fue mapeada enteramente por medio de cósmidos – secuencias de ADN que cargan y multiplican partes del genoma que se pretende estudiar. Una de las investigadoras, Anete Pereira de Souza, de la Unicamp, fue a Heidelberg, en Alemania, para aprender a hacer la llamada biblioteca de cósmidos, la materia prima del secuenciamiento del genoma, que representa el cromosoma completo.

Con la Xanthomonas fue diferente. En los 11 laboratorios de secuenciamiento, distribuidos entre la Universidad de São Paulo (USP), Universidad Estadual Paulista (Unesp) y Unicamp, sobre la coordinación de dos centrales, una en la Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias (FCAV) en la Unesp de Jaboticabal y otra en el Instituto de Química de la USP, se hizo primero un scaffold, un mapa virtual, es decir, el esqueleto del genoma. Dicha estructura fue montada con cerca de 2 mil cósmidos, cada uno con entre 35 mil y 50 mil pares de bases de nucleótidos (adenina, citosina, guanina y timina).

Se mapeaban las dos puntas de cada cosmídeo, de modo tal que después se pudieran encajar y dieran así una visión general del genoma. Una visión más detallada iba saliendo a medida que se iban aplicando los shotguns, clones menores, de entre 1,5 mil y 3 mil pares de bases, literalmente lanzados sobre el genoma, que se sobreponen enteramente al mismo, reproduciendo su estructura. Desde agosto del año pasado, cuando se inició el trabajo, los investigadores produjeron 205 mil shotguns, cuyos procesos de montaje ya se conocían de la Xylella.

La novedad es que esta vez los cósmidos también se hicieron íntegramente en Brasil. Luiz Roberto Furlan, investigador del laboratorio central de genoma de la Unesp de Jaboticabal no olvidará fácilmente el día en que los coordinadores del proyecto le encargaron la tarea de construir la biblioteca de cósmidos. Furlan, desde la época de la facultad más conocido como Cedral, por causa de la ciudad del interior paulista donde nació, sabía acerca de la importancia de la misión, pero no tenía la menor idea de cómo hacer. Viajes a Alemania, ni pensar: todo se haría en Brasil mismo.

Resumiendo: dos meses después, Cedral había recreado la metodología y estaba en condiciones de vérselas con el vector Lawrist, un pedazo de ADN circular que incorpora fragmentos del genoma. “No podía creerlo cuando los primeros cósmidos salieron bien”, dice. “Creí que había hecho algo mal”, agrega. Otra diferencia es que el Laboratorio de Bioinformática de la Unicamp centralizó el análisis del genoma, pero contó con el refuerzo de dos núcleos de bioinformática creados en Jaboticabal y en la USP. Así fue más fácil, aunque la Xanthomonas tiene un genoma con 5,2 millones de pares de bases, el doble del de la Xylella. A él se dedicaron 51 investigadores, un grupo discreto si se lo compara con los 207 de la Xylella y los 140 de la caña de azúcar. Hasta ahora, incluyendo el secuenciamiento de la campestris, se invirtieron 2,2 millones de dólares, menos de la mitad del presupuesto de 5,4 millones de dólares destinado por la FAPESP.

Apodos
La tranquilidad con la que los investigadores trabajaron puede medirse por el sobrenombre con el que trataban cotidianamente a la Xanthomonas: Xanthô. En los artículos científicos, era denominada Xac, abreviación de Xanthomonas axonopodis pv citri (pv significa patovar, una clasificación basada en el tipo de planta atacada por la bacteria). Hasta hoy, la Xylella es simplemente Xylella, sin apodos.

El equipo atravesó momentos difíciles en el final de mayo de este año, cuando el esqueleto del genoma ya estaba listo. Tenía 95 partes. El problema es que éstas que no se encajaban bien. Nada desesperante para una de las coordinadoras del proyecto, Ana Cláudia Rasera da Silva, del Instituto de Química de la USP. Desde los 10 años de edad ella pasaba días enteros sobre la alfombra de la sala de su casa armando rompecabezas de 2 ó 3 mil piezas, como el de un castillo medieval rodeado por selva que decora su laboratorio. Para ella, el genoma es “tan solo un rompecabezas un poco mayor, con millones de piezas”. Ana Cláudia garantizó que, ante los impasses, no perdió la paciencia ni el buen humor en ningún momento.

En la pantalla de la computadora, los tramos conocidos se extendían en líneas rectas y muchas veces paralelas a causa de las partes comunes. Entre ellas había cerca de 30 áreas en blanco, sin ninguna información. En rigor, ellas no deberían existir: los millares de shotguns arrojados sobre el genoma parecían suficientes para no dejar ningún tramo descubierto.

Repeticiones preciosas
Pasaron semanas hasta que Ana Cláudia y Meidanis lograron delimitar el problema: las áreas en blanco eran, a decir verdad, tramos repetidos, y la computadora no sabía qué hacer con ellas. Para entender qué eran esas repeticiones, Ana Cláudia, con la ayuda del post doctorando Marcelo Trindade y el professor Shaker Chuk Farah, ambos también del Instituto de Química de la USP, iniciaron el trabajo artesanal: eliminaron las partes repetidas y las piezas se encajaron. Más tarde verían que en ellas están las características más gratificantes y, si nos dejamos llevar por el relato de los investigadores, más deslumbrantes del genoma de la Xanthomonas.

La mitad de las repeticiones eran transposones, los genes saltadores que brincan de un punto a otro del cromosoma o hasta de un cromosoma a otro. Parecen capaces de inducir a los vecinos a expresarse o desactivar otros genes. El equipo de Marie-Anne Van Sluys, del Instituto de Biociencias de la USP, ya ha identificado 51. Uno de ellos es el Xatn1 (informalmente llamado xatinho 1), que se repite 18 veces en el genoma; el xatinho 2, solo cinco. Según ella, hay fuertes indicios de que otro xatinho puede provenir de otra bacteria, la Pseudomonas, mediante un mecanismo denominado transferencia horizontal de genes, que ocurre entre especies diferentes.

Costó descubrir que la otra mitad de las repeticiones -también dilucidadas por medio de cósmidos – eran estructuras secundarias del ADN. Las mismas forman manijas, que funcionan como pinzas e, lo que es más grave, impiden que una enzima, la polimerasa, se deslice a lo largo de la molécula y la caracterice: allí es donde surgían las áreas sin ninguna información. En seis meses de trabajo, los investigadores lograron deshacer la mayoría de las manijas. Alfinal de noviembre, faltaban apenas dos, queharían postergar por algunas semanas la fiesta de conclusión del genoma. “Sabíamos desde el inicio que sería difícil”, reconoce Jesus Aparecido Ferro, investigador de la Unesp de Jaboticabal y uno de los coordinadores del proyecto.

Resueltos casi todos los problemas, los investigadores pretenden ahora entender los mecanismos específicos que puedan explicar, por ejemplo, por qué la Xanthomonas citri causa el chancro cítrico y la X. campestris, parecidísima, ataca los repollos. Otra duda: ¿Cuán diferentes pueden ser bacterias del mismo género? Las primeras comparaciones indican que existe una gran semejanza entre los genes, empero la organización de los mismos sea muy diferente.

Dilemas evolutivos
Otra especie cercana, la X. albilineans, la cual los equipos de Jaboticabal y São Paulo pretenden secuenciar el año que viene, es lenta para reproducirse, tal como la Xylella, y solo vive en el xilema de la caña de azúcar. Biológicamente es más parecida a la citri. Se piensa que puede tratarse del eslabón perdido entre ambas especies. Las comparaciones entre la Xylella y la Xanthomonas ya han comenzado. Las secuencias de aminoácidos -las moléculas que forman las proteínas- de ambas son bastante similares. La primera es, digamos, más sencilla. Casi no tiene transposones y manijas, por ejemplo. “La impresión es que la Xylella es una Xanthomonas encogida o que la Xanthomonas es una Xylella ampliada”, bromea Ana Cláudia.

“De cualquier manera, ambos organismos tuvieron un ancestro común”, dice Sérgio Russo Matioli, especialista en evolución del Instituto de Biociencias de la USP. “Si reunimos evidencias de que el genoma de ese ancestro era del tamaño del de la Xanthomonas , eso significa que hubo una disminución en Xylella, de lo contrario hubo un aumento en Xanthomonas. “Sin embargo, si la especie original tuviera un genoma de tamaño intermedio, tanto podría haber aumentado el genoma del linaje que originó la Xanthomonas como disminuido el del linaje que llevó a la Xylella.

Ese campo de la evolución tropieza con la dificultad de encontrar registros fósiles de las bacterias. Aún así, el secuenciamiento de genomas completos ha ayudado bastante para comprender las novedades evolutivas. Tiempo atrás, por ejemplo, cuando se concluyó el secuenciamiento de la Escherichia coli, la bacteria usada como modelo para estudios genéticos y bioquímicos, se descubrió algo impresionante: la mitad del genoma tenía funciones desconocidas. Inmediatamente gano adeptos la idea de que esa parte del genoma podría estar involucrada en actividades fuera de la placa de Petri, receptáculo en cual los investigadores colocan los microorganismos que desean estudiar. Por esa razón, Matioli recuerda que, “si esa hipótesis estuviera correcta”, solamente estudios que tengan en cuenta los ambientes naturales podrían aclarar la función de todos los genes de los microorganismos.

Diferencias
Ana Cláudia confiesa: “El genoma de la Xanthomonas es más sofisticado”. Uno de sus argumentos es que la Xanthomonas tiene una densidad debases guanina y citosina considerada alta (65%). En la Xylella es del 53%. Como consecuencia de ello, el ADN de la primera es más estable, pero también más difícil de interpretarse por medio de la enzima polimerasa; por eso costó encontrarlo, entenderlo y desanudar sus manijas. Aún así, es un punto polémico. “Todo genoma tiene su misterio”, recuerda Meidanis. Según su punto de vista, pesa mucho también la familiaridad que se tenía con cada microorganismo. De la Xylella, recuerda, “no se sabía casi nada”, al tiempo que la Xanthomonas era razonablemente conocida, incluso con algunos genes ya descritos.

Vamos a los hechos. La Xylella se reproduce lentamente, en entre 20 y 30 días. Depende de insectos – las saltarillas tiradoras, cierto tipo de saltamontes – para desplazarse, y sobrevive apenas en el propio insecto o en los vasos conductores de la sabia de plantas como los naranjos y las parras. Es tentador, empero arriesgado, decir que la Xanthomonas vive en mejores condiciones: se reproduce más rápidamente, cada dos días. Y es una bacteria de vida libre: se desplaza a través del aire, del agua y por el suelo.

En los próximos años, es probable que las informaciones que brotan del genoma ayuden principalmente a encontrar los puntos débiles de la Xanthomonas citri. Por cierto, ya se está empezando a ver cómo dicha bacteria causa el chancro cítrico. Son importantes en ese proceso los genes avr (de avirulencia, responsables por la patogenicidad). Existen cuatro copias de ellos en los dos plásmidos, ADN circulares, mucho menores que el cromosoma. La célula vegetal solamente acciona los mecanismos de defensa cuando reconoce las proteínas generadas por el avr. Pero, por lo que parece, la Xanthomonas logra burlar los mecanismos de alerta, infiltrándose y prosiguiendo la conquista de la célula hospedadora.

Participan del proceso de infección cerca de 20 proteínas, el llamado sistema secretorio tipo 3, inexistente en la Xylella. “Es probable que algunas proteínas lleguen al núcleo y modifiquen la expresión génica de la planta”, dice Ronaldo Bento Quaggio, investigador de peculiar formación: es físico y trabajó como cineasta (es graduado también en Cine) antes de entrar al pos grado y convertirse en profesor del Instituto de Química de la USP. Allí también trabaja el investigador canadiense Shaker Farah, que estima que existen ente 50 y 80 proteínas involucradas en la patogenicidad o el desarrollo del chancro cítrico.Las dudas se suman a los logros. Pasado el susto inicial, Cedral evalúa: “Hubo un notable crecimiento científico del equipo”. El laboratorio de la Unesp de Jaboticabal, por ejemplo, se prepara para producir bibliotecas de ADN, ahora de todos los tipos – shotguns, cósmidos o clones aún mayores, empleados en el estudio del genoma humano para otras instituciones.

Solo se puede pensar en prestación de servicios porque los métodos de trabajo cambiaron bastante. En Jaboticabal, la selección de las colonias con los clones – antes hecha a mano, con mondadientes – hoy es realizada por un robot, dotado de un conjunto de agujas que él mismo lava y esteriliza. El robot puede hacer entre 80 y 100 placas de 96 pozos (orificios) en cuatro horas. Manualmente, idéntica tarea llevaría un día entero, con el trabajo de ocho o diez personas.

Perspectivas
En los laboratorios dedicados al genoma en el Estado de São Paulo cobra fuerzalaidea de automatizar el secuenciamiento lo máximo posible para que el equipo se atenga al análisis de los resultados, una meta aparentemente factible: en la Xylella el secuenciamiento aún fue trabajoso, con muchas etapas manuales, pero con las nuevas máquinas ya es posible poner el ADN para secuenciar por la mañana y recoger el resultado al final de la tarde. Allí puede residir – en el trabajo de descubrir las funciones biológicas de los genes – el punto fuerte del equipo brasileño. “Sabemos anotar”, asegura Cedral. Algo semejante ocurre hace años en la Fórmula 1: intuitivos y audaces pilotos brasileños ganando carreras en los coches hechos en otros países.

Bacterias devastadoras

El currículum del género Xanthomonas no es para nada modesto. No tanto por el número de especies, apenas 20, sino por su alcance: atacan 392 plantas, con variedades específicas para frijoles (porotos), arroz, mandioca (yuca), algodón, maíz, cana, trigo y soja, por ejemplo. “Hay una Xanthomonas para casi todas las plantas cultivadas, sobre todo en climas cálidos”, dice Rui Pereira Leite Jr., investigador del Instituto Agronómico del estado de Paraná (Iapar), que sigue el trabajo del grupo paulista. Fue él quien suministró las muestras de la X. citri para su secuenciamiento. “En climas fríos, las Xanthomonas casi no aparecen”, dice. Mientras que la Xylella es un problema cicunscripto principalmente a Brasil y Argentina, las bacterias de este otro género destruyen las plantaciones en Asia, Africa y América. En Brasil su presencia se extiende desde Rio Grande do Sul hasta Rio Grande do Norte.

El chancro cítrico es solo una de las enfermedades causadas por las Xanthomonas. Relatado por primera vez en 1889 en Japón, actualmente es endémico en todo el sudeste asiático. Llegó a Brasil en 1957 y solo avanzó. “Si el chancro cítrico se instala definitivamente en Brasil, algunas variedades de cítrus no podrán cultivarse más, como los limones gallego y siciliano, las naranjas del tipo bahía y hamlim y el pomelo (grapefruit, toronja), que son más susceptibles a la bacteria”, dice Leite Jr. Según él, a causa de esa plaga Argentina ya no cultiva esas variedades, y en este momento los plantadores de Florida, en Estados Unidos, pierden el sueño de preocupación ante igual posibilidad.

El chancro cítrico está asociado a la larva minadora de los cítricos (Phyllocnistis citrella), detectada en Brasil en 1996. La larva construye galerías en las hojas, y por allí entran las Xanthomonas. Cuando proliferan, originan lesiones salientes en las hojas y en los frutos, que acaban cayendo. Para evitar que la plaga se expanda, no existen alternativas: es necesario arrancar las plantas contaminadas. En 1999, el estado de São Paulo eliminó cerca de un millón de plantas. La cuenta que debe pagarse también es alta: en los últimos dos años, el control y la erradicación costaron cerca de 50 millones de reales. “El combate al chancro cítrico mejoró bastante”, dice Leite Jr. “Si continúa así, la situación podrá mantenerse bajo control.”

EL PROYECTO
Genoma Xanthomonas
Modalidad
Proyecto del ProgramaGenoma FAPESP
Coordinadores
Jesus Aparecido Ferro – Facultadde Ciencias Agrarias y Veterinariasde la Unesp de Jaboticabal; yFernando de Castro Reinach yAna Cláudia Rasera da Silva – Instituto de Química da USP
Inversión
US$ 2.210.328,17

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