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Ciencia

Revelado con detalles

Investigaciones muestran genes y mecanismos que pueden ayudar en el combate contra la bacteria causante del 'amarelinho'

miguel boyayanHace cinco años no se sabía casi nada sobre la bacteria Xylella fastidiosa, causante de una de las peores plagas de la citricultura: la Clorosis Variegada de los Cítricos (CVC), también conocida en Brasil como ‘amarelinho’, que ocasionaba pérdidas anuales del orden de los 100 millones de dólares tan solo en São Paulo, el principal estado productor. Pero la situación ha cambiado radicalmente. Desde hace un año, y a medida en que han ido madurando las 21 investigaciones del Proyecto Genoma Funcional de la Xylella fastidiosa, financiado por la FAPESP, se han vuelto claros los mecanismos por los cuales ese microorganismo infecta a los naranjos y crece dentro de éstos.

Participan de dicho proceso una serie de genes y proteínas recientemente descubiertos y hallados en abundancia -son 30 genes importantes identificados en el Instituto Agronómico de Campinas, y 30 proteínas esenciales para la bacteria descubiertas en la Universidad Estadual de Campinas (Unicamp), por ejemplo.

A propósito: ya han comenzado las investigaciones que permitirán desactivar esos genes y proteínas, de manera tal de impedir la propagación de la bacteria. El resultado final adquirirá probablemente la forma de una vacuna contra el ‘amarelinho’. Hasta ahora el que más ha avanzado para hallar tal solución ha sido João Lúcio Azevedo, investigador de la Escuela Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq) de la Universidad de São Paulo (USP) y de la Universidad de Mogi das Cruzes (UMC).

Con base en los hallazgos más recientes del Genoma Funcional, que reúne a casi 80 investigadores de universidades e institutos públicos y privados, Azevedo implantó en el genoma de la Pantoea agglomerans y de la Methylobacterium sp, dos bacterias inofensivas, que conviven con la Xylella, un gen que ayuda a digerir la goma fastidiana -una sustancia gelatinosa, probablemente esencial en la formación de las colonias de Xylella y en la adherencia de las bacterias a las paredes de los vasos conductores de agua y nutrientes de los naranjos. De esta manera, la goma y las colonias, en una acción conjunta, obstruyen los canales de circulación de los nutrientes, en un lento proceso que lleva a que las plantas se debiliten poco a poco.

Azevedo sabrá en los próximos tres meses si las bacterias escogidas detienen efectivamente la formación de la goma fastidiana en los naranjos, cuya composición fue detallada durante todo el año pasado por el equipo de Eliana Lemos, de la Universidad Estadual Paulista (Unesp) de Jaboticabal. Ése fue otro avance importante en la lucha contra el ‘amarelinho’. Ahora se sabe que ese compuesto, vital para las bacterias y fatal para los naranjos, es una mezcla de cuatro tipos de azúcares, y es menos densa y viscosa que la goma xantana, producida por otra bacteria que infecta a los cítricos, al fríjol y al repollo: la Xanthomonas citri, cuyo secuenciamiento fue concluido al final del año 2000.

El descubrimiento de la estructura de la goma fastidiana, según Lemos, facilita la búsqueda de mecanismos que puedan bloquear su formación, debido a que especifica los objetivos que deben seguirse, evitando así una batalla a ciegas o la escasez de explicaciones acerca de por qué una táctica funciona o deja de funcionar. Como el equipo de la Unesp logró que la Xylella produjera goma fastidiana cuando ésta es cultivada en laboratorio en condiciones especiales, ha surgido así una vertiente aún más aplicada. A medida en que los procesos de producción vayan siendo optimizados, la goma fastidiana despuntará como una alternativa ante su similar producida por la X. citri y empleada industrialmente como espesante de papel, pinturas y alimentos.

Bloqueo de vasos
Pero la vacuna que para detener la acción de la goma, y en consecuencia también el crecimiento de las bacterias, no es la única perspectiva con la cual trabaja el grupo paulista. Con base en el secuenciamiento del genoma de dicha bacteria, iniciado en 1998 y concluido en 2000, los investigadores también hallaron una molécula que controla ciertos genes ligados al desarrollo de la enfermedad en las naranjas. Dicha molécula, llamada factor de señal difuso, deriva de un ácido graso (un tipo de grasa) y es probablemente el resultado de la acción de dos genes, según Marcio Lambais, uno de los autores del descubrimiento, también de la Esalq. Resta todavía detallar su estructura química, pero ya se está pensando en producir esa molécula en laboratorio y aplicarla en la planta, de manera tal que pueda impedir la activación de genes que ayudan a que la enfermedad avance. “Funcionaría como un plaguicida”, planea Lambais.

Analizados en conjunto, estos resultados refuerzan cada vez más la idea de que la agresividad -o la virulencia- de la bacteria está directamente relacionada con su capacidad de formar colonias, adherirse a las paredes del xilema (los vasos que transportan agua y sales minerales a través de la planta) y provocar así su obstrucción -procesos en los cuales la goma fastidiana parece ser esencial. Por cierto, todo indica que el bloqueo de dichos vasos es el principal factor que perjudica, y de manera tan intensa, el metabolismo de los naranjos, de acuerdo con la evaluación de Eduardo Caruso Machado, del IAC.

En asociación con un equipo de la Esalq, Machado descubrió que la cantidad de agua que llega a las hojas es casi un 60% menor en los naranjos enfermos. No importa si está lloviendo intensamente, como es común en noviembre y diciembre en el norte del estado de São Paulo, de donde sale la tercera parte de la producción mundial de naranjas: las plantas infectadas se muestran como si sufrieran la falta de agua aun con el suelo inundado -se muestran débiles, con las hojas marchitas y los frutos pequeños.

Pero si bien los árboles llegan a ese estado solamente una vez que han pasado algunos años desde el comienzo de la infección, la reducción del flujo de agua -la causa más inmediata de esa manifestación del ‘amarelinho’- aparece mucho más rápido: tres meses después de que los árboles son contaminados por la Xylella. Ese síntoma, ya notado en laboratorio, escapa al productor, que sólo se da cuenta de la infección debido a la apariencia externa de los árboles y sus frutos, ya en un estadio más avanzado de la enfermedad.

Pero internamente existen otras complicaciones. Los estudios indican que los naranjos pierden la mitad de su capacidad de ejecutar la fotosíntesis, el proceso mediante el cual producen reservas de energía (glucosa). Pequeños poros ubicados en la superficie de las hojas, llamados estomas, permiten la entrada del gas carbónico indispensable para la fotosíntesis. Si el xilema está obstruido, aunque sea parcialmente, y no llega agua a las hojas, los estomas se cierran, como si la planta estuviera en tiempo de sequía. En consecuencia, el ciclo de producción de energía pierde eficacia.

Pero la obstrucción de los vasos por sí sola no explica la merma en la fotosíntesis. Los investigadores creen que la bacteria debe producir sustancias específicas -toxinas todavía desconocidas- que ayudan a bloquear la producción de energía. Esta conclusión emergió de experimentos con naranjos contaminados, pero bajo condiciones al menos en apariencia bastante favorables, con abundancia de agua y con un abastecimiento de gas carbónico 140 veces superior al normal. Sería una forma de eliminar la influencia de los estomas y la falta de agua, pero aun así, y para sorpresa general, la fotosíntesis de los naranjos enfermos fue un 20% menor -por lo tanto, la pérdida fue reducida, pero no enteramente eliminada.

Genes de adherencia
Marcos Antonio Machado, coordinador de otro equipo del Instituto Agronómico, investigó el problema desde otro ángulo: en lugar de analizar el metabolismo de la planta, examinó la actividad de los genes de la Xylella. Su trabajo profundizó las conclusiones de otros grupos del Genoma Funcional, que ya habían advertido que las colonias de bacterias y la adherencia a las paredes de los vasos de la planta eran decisivas en las transformaciones que hacen que el árbol se debilite y pare de producir.

Machado comparó la expresión de 2.205 genes de laXylella en dos situaciones de cultivo en laboratorio: la primera de éstas, denominada condición de aislamiento primario, contemplaba bacterias recientemente extraídas de las plantas infectadas, que preservaban su capacidad de colonizar rápidamente a las plantas; la otra, de aislamiento secundario, estaba integrada por bacterias retiradas mucho antes, que ya se habían propagado 40 veces y se multiplicaban mucho más lentamente al ser inoculadas en los naranjos, de acuerdo con pruebas ya realizadas anteriormente.

Utilizando un biochip -una lámina que permite diferenciar genes activos e inactivos- producido por el grupo de Mogi das Cruzes, Machado detectó que alrededor de 30 genes se comportan de manera diferente, con respuestas que dependen esencialmente del parentesco con la bacteria retirada de la planta. De una manera general, las bacterias genéticamente más parecidas a la Xylella encontrada en la propia planta, mantenidas en la condición de aislamiento primario, presentan mayor capacidad de ocasionar la enfermedad -la llamada patogenicidad- que las del otro grupo. En el primer caso, se encontraba activo un número mayor de genes vinculados al proceso de adherencia a la planta.

En otro trabajo conjunto, en este caso con Gustavo Goldman, de la Facultad de Farmacia de la USP de Ribeirão Preto, Marcos Machado analizó el grado de expresión de esos genes. Comparó las dos situaciones de crecimiento y verificó que en el aislamiento primario había genes relacionados con la adherencia alrededor de 20 veces más activos que en la otra condición de crecimiento. De este modo pudo confirmar la importancia de los genes de adherencia. Con todo, permanecía la pregunta: ¿el mismo efecto se manifestaría en otras plantas? Curiosamente, la generación de bacterias próxima al retiro de la planta -con más copias de los genes de adherencia- infectó a la vinca (Catharanthus roseus), de manera similar a las naranjas. Fue un hallazgo importante. “La patogenicidad no parece estar relacionada con la especie de planta infectada, sino fundamentalmente con la bacteria”, comenta Machado.

Lento crecimiento
El equipo de José Camillo Novello, de la Unicamp, trabajó con el producto de los genes: las proteínas, que en principio, si fueran bloqueadas, ayudarían a impedir el avance del ‘amarelinho’. Tras una selección inicial, los investigadores del Laboratorio de Química de Proteínas identificaron 142 proteínas producidas en mayor cantidad por la Xylella, pero se abocaron a 30 de éstas, asociadas a la capacidad de adherencia, a la absorción de nutrientes y a la toxicidad de la bacteria. Son proteínas que suscitan interés, fundamentalmente porque la bacteria las exporta al medio intercelular, tal como los investigadores lo describen en un artículo que será publicado en Proteomics en febrero. “Estas proteínas constituyen potenciales objetivos en el combate contra el ‘amarelinho'”, dice Marcus Smolka, uno de los integrantes del equipo de Novello, “porque en principio es más fácil producir un compuesto que actúe sobre una proteína que esté fuera de la bacteria que uno que se encuentre dentro de ésta.”

Al analizar el patrón de esas proteínas, el grupo de la Unicamp constató que la Xylella carece de un mecanismo común a otras bacterias, que permite fabricar proteínas rápidamente. De acuerdo con Smolka, esta característica ayuda a explicar el lento crecimiento de la Xylella, que demora entre ocho y diez horas para dividirse, mientras que la Escherichia coli no tarda más de 20 minutos. “Todo lleva a creer que la Xylella no logra responder de manera eficiente a las sustancias producidas por el sistema de defensa de la planta”, comenta. “Quizá por eso solamente logra crecer en agregados, lo que ofrece una forma de protección.”

Imprevistos
Pero no solamente de avances vive la ciencia. El año pasado, cuando parecía que la bacteria estaba a punto de ser dominada, se mostró dura de caer, e interpuso nuevos desafíos a los investigadores, en una señal indicativa de que las próximas etapas del trabajo pueden ser más complicadas de lo que se imaginaba. Surgieron resultados inesperados cuando se intentó contaminar naranjos y plantas de tabaco con bacterias genéticamente alteradas, en las cuales la investigadora Patrícia Monteiro, por entonces trabajando para el Fondo de Defensa de la Citricultura (Fundecitrus), había desconectado genes relacionados con la patogenicidad.

Los estudios llevados a cabo hasta el momento indican que la cepa utilizada -aislada en Jales, interior de São Paulo, y conocida por la sigla J1a12- no es virulenta. Una mala noticia, pues de ese modo, no se puede saber si la desactivación de los genes realmente funcionaría a punto de tal impedir el desarrollo del ‘amarelinho’. La otra cepa más agresiva, la 9a5C, secuenciada en el marco del proyecto Genoma Xylella, se ha mostrado resistente a la transformación genética.

“Puede ser que la J1a12 ocasione los síntomas solamente mucho después, debido a que crece más lentamente”, comenta Patricia. En busca de cepas más agresivas cuyos genes puedan ser desactivados, los investigadores encontraron una alternativa prometedora: la B111, aislada en la región de Bebedouro, capaz de contaminar a los naranjos con mayor eficacia que la de Jales, pero aun así, menos virulenta que la 9a5C. Una vez superada esa etapa todo será más fácil, pues Beatriz Mendes y Francisco Mourão, ambos de la USP, ampliaron el dominio de la técnica de producción de naranjos genéticamente modificados -al margen de la variedad Hamlin, obtenida en 2001, produjeron árboles transgénicos de naranja pera, valencia y natal. El laboratorio en el que trabajan está listo para recibir los genes de resistencia al ‘amarelinho’ ni bien sean hallados por los otros grupos de investigación.

EL PROYECTO
Genoma Funcional de la Xylella fastidiosa, con 21 Proyectos Individuales de Investigación
Modalidad
Programa Genoma FAPESP
Coodinadores
Jesus Aparecido Ferro – Unesp, y Ana Claúdia Rasera da Silva y Luiz Eduardo Aranha Camargo – USP
Inversión
R$ 2.048.228,98 y US$ 2.211.758,01

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