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Biofotónica

Los espectros de la vida

Científicos emplean una pinza óptica y espectroscopía para facilitar los estudios en células vivas

En la pantalla de un televisor ubicado en el medio de un laboratorio apiñado de láseres, microscopios y computadoras, es posible ver un un glóbulo rojo de la sangre siendo estirado, y hasta un parásito vivo: el protozoario Leishmania amazonensis, que provoca una enfermedad llamada leishmaniasis, debatiéndose para escapar de una trampa invisible que le impide de seguir moviéndose en una placa de cultivo de microorganismos. Eso que  estira hematíes y sujeta al microorganismo unicelular son los haces invisibles de láser, que trabajan como si fueran pinzas ópticas. Un aparato montado en el Instituto de Física Gleb Wataghin (IFGW) de la Universidad Estadual de Campinas (Unicamp) usa estas pinzas en un trabajo que se encuentra en desarrollo desde comienzos de la década de 1990. La más reciente innovación del Laboratorio de Aplicaciones Biomédicas de Láseres del instituto consistió en unir la pinza óptica con un sistema de espectroscopía para el análisis de proteínas, lípidos, aminoácidos, calcio y otras sustancias químicas existentes en células y microorganismos. Todo ello como si fuera una película y con los análisis realizándose en tiempo real en los organismos vivos capturados y moviéndose.

La diferencia con los sistemas actuales de espectroscopía es comparable a una fotografía que congela un determinado momento, mientras que la película muestra el proceso a lo largo de un determinado tiempo. “Nuestra intención fue juntar la pinza óptica, los láseres y la espectroscopía para que varios tipos de análisis se realicen de manera simultánea sin destruir el material analizado”, dice Carlos Lenz Cesar, coordinador del grupo que desarrolla las pinzas ópticas. Cesar descubrió la pinza óptica de la mano de su creador, el físico Arthur Ashkin, cuando hacia su posdoctorado en los laboratorios Bell, de la empresa de telecomunicaciones AT&T, entre 1988 y 1990, en Estados Unidos. Los trabajos con trampas ópticas empezaron a comienzos de los años 1970. Al principio, Ashkin usaba el láser para mover y estudiar partículas sólidas, primero con microesferas de látex y después con átomos. Los primeros estudios con material biológico  nivel celular también fueron llevados a cabo por Ashkin con la bacteria Escherichia coli y con hematíes y publicados en 1987 en la revista Nature.

El sistema de espectroscopía complementa con su capacidad de microanálisis las propiedades mecánicas para manipular microorganismos y células vivas inherentes  a la pinza óptica. De esta manera, la fuerza de adherencia entre un parásito y la superficie de una célula en el preciso momento de la infección puede observarse tanto desde el punto de vista mecánico como desde la óptica bioquímica. Otros ejemplos de medidas mecánicas con pinzas ópticas son el análisis de fuerzas de impulso de los microorganismos, la viscosidad de los fluidos y la elasticidad de las membranas celulares.

El trabajo de unión de la espectroscopía con la pinza óptica formó parte de la tesis doctoral de la física Adriana Fontes, y fue aceptado para su publicación en la revista Physical Review E. El trabajo también rindió un premio al mejor póster presentado en el Congreso Photonics West, en Estados Unidos, que juntó en enero de este año a 15 mil participantes de las áreas de fotónica y biofotónica. Adriana, actualmente posdoctoranda del IFGW, trabaja hace ocho años, desde la época de su iniciación científica, con láseres en el mismo laboratorio, y está vinculada, al igual que todo el equipo del profeor Lenz, al Centro de Investigación en Óptica y Fotónica, uno de los diez Centros de Investigación, Innovación y Difusión (Cepid, sigla en portugués) financiados por la FAPESP.

En la práctica, los investigadores unieron un microscopio óptico convencional, que posee una cámara de video acoplada y se usa para observar  microorganismos, con un espectrómetro instalado junto a este instrumento clásico de laboratorio. La pinza consiste en un haz de láser focalizado por el objetivo en un punto de la imagen. Por la pantalla del monitor es posible observar partículas al ser aprisionadas en el foco del láser y movidas con gran precisión, sin daños celulares. El haz de láser es invisible, y opera en el infrarrojo, pecisamente para evitar la absorción de la luz y la producción de calor, que causaría daños térmicos. El láser empleado como pinza en el IFGW fue fabricado a base de neodimio, uno de los elementos conocidos con el nombre de tierras raras, cuya luz es emitida en la longitud de onda de 1.064 nanómetros (nm). Por otra parte, la absorción es necesaria cuando lo que se desea es destruir corpúsculos o perforar paredes celulares con un bisturí óptico. En este caso, los investigadores utilizan otro láser a base neodimio con luz emitida en la mitad de la longitud de onda del infrarrojo, 532 nm, que afecta a  la célula únicamente en la zona deseada.

Al comportarse como una partícula, la luz transfiere el impulso siempre que el haz luminoso es desviado o absorbido, permitiendo que un cono de rayos de luz capture otra partícula. Albert Einstein descubrió este comportamiento de la luz en 1905 en el estudio sobre el efecto fotoeléctrico. Einstein designó a estas partículas luminosas con el nombre fotones (del griego photos, luz) y demostró que las mismas transportan energía, además de impulso. Con este trabajo Einstein ganó el Premio Nobel en 1921, y no por la famosa teoría de la relatividad.

Las fuerzas generadas por esta trampa óptica son muy pequeñas. Una excelente pinza óptica es capaz de generar fuerzas con valores máximos en alrededor de 200 picoNewtons (pN), equivalente a la milmillonésima parte de un kilo. En estas dimensiones, las pinzas ópticas son capaces de capturar partículas de tamaños que van desde los 40 ó 50 nanómetros (un nanómetro es un milímetro dividido por un millón de veces) hasta los 20 ó 30 micrómetros (un micrómetro es igual a un milímetro dividido por mil). Para capturar un microorganismo vivo, con fuerza motora propia e intentando escapar de la trampa, una pinza debe ser capaz de suministrar de mínima fuerzas de 50 pN. Una excelente prueba de la calidad de una pinza óptica consiste en demostrar que ésta es capaz de capturar a un espermatozoide vivo. Aunque estas fuerzas ópticas son muy pequeñas, son de la misma magnitud que las fuerzas que actúan en las células y en los microorganismos. Por eso, la pinza óptica es la herramienta ideal para medir intensidades de fuerzas, al margen otras propiedades mecánicas, en el universo microscópico.

En el ámbito de la espectroscopia, el trabajo se realizó con varias técnicas, pero siempre con el mismo objetivo de descubrir las “firmas” o “impresiones digitales” que cada sustancia o molécula emite cuando interactúa con la luz. Una de estas firmas es el resultado de las vibraciones moleculares, cuya frecuencia depende de las masas y de las fuerzas existentes entre los átomos de una molécula. El resultado es un espectro en el cual se observa la intensidad de las ondas electromagnéticas emitidas en cada frecuencia. “Descubrimos la presencia de una determinada molécula a través del pico de intensidad de su frecuencia de vibración”, dice Lenz.

Las vibraciones visibles
Como los materiales biológicos poseen muchas moléculas que, a su vez, presentan muchos picos, la identificación de las sustancias se lleva a cabo por medio de una comparación con una biblioteca de espectros. “Estas vibraciones moleculares también aparecen como una modulación en un haz disperso de luz visible y puede detectarse por medio de la llamada espectroscopía Raman”. Ésta consiste en un proceso de dispersión con un fotón incidente y un fotón disperso, pero también es posible que se den procesos con dos fotones incidentes y un fotón disperso, llamados dispersiones o espectroscopía hiper Rayleigh. Procesos multifotónicos como éstos solamente existen en caso de que todos los fotones involucrados entren en colisión con la misma partícula al mismo tiempo. Por eso estos procesos requieren de láseres pulsados, donde los fotones se emiten al mismo tiempo, en lugar de la emisión constante de fotones de los láseres continuos.

La luz que es dispersa por los procesos de espectroscopía es a su vez capturada en el mismo lente objetivo de la pinza óptica, y enviada al espectrómetro, donde se la descompone y se la analiza para descubrir las vibraciones moleculares. “De esta manera, sabemos cuáles son las moléculas que están en aquella célula o ser vivo”, dice Adriana. “Es una información química”. Con este sistema es posible recolectar los espectros de un parásito, como el protozoario Leishmania, por ejemplo, mientras que la pinza óptica lo mantiene sujeto en una misma posición, pero vivo y moviéndose. También sería posible seguir modificaciones bioquímicas que ocurran cuando otra pinza lo acerque a la célula que pretende infectar.

Para espectroscopías de un fotón, como Raman, los investigadores utilizaron un láser continuo de titanio zafiro, cuya emisión puede seleccionarse en la región del infrarrojo entre 780 y 1.000 nm. En tanto para las espectroscopías multifotones, se valieron de un láser de titanio zafiro con pulsos de duración muy corta: 100 femtosegundos (fs), el tiempo necesario para que la luz recorra una distancia de apenas un tercio del diámetro de un cabello. Un femtosegundo es igual a un segundo dividido por un trillón de veces.

Otra firma de moléculas muy utilizada es la fluorescencia, un proceso mediante el cual ciertas moléculas emiten una luz típica cuando se las ilumina con fotones con mayor energía que los fotones emitidos. Sin embargo, como son pocas las sustancias con fluorescencia eficiente, suele emplearse la introducción de colorantes en calidad de marcadores. “El problema es que estos colorantes tienden a ser tóxicos, o citotóxicos, y a emitir luz por poco tiempo, debido a la fotodegradación”, dice Adriana. Una solución a estos problemas es el llamado punto cuántico, o quantum dot, nanocristales de semiconductores, como el  sulfuro, el selenuro y telururo de cadmio, indicados en aplicaciones biológicas. La mayor ventaja del punto cuántico con relación a los colorantes es su gran fotoestabilidad, que permite la obtención de imágenes durante horas seguidas sobre iluminación intensa. Asimismo, tiene citotoxicidad muy baja. Otra gran ventaja es que el tamaño del punto cuántico controla el color de la fluorescencia que éste emite. Es posible obtener fluorescencia con base en puntos cuánticos de telururo de cadmio en azul, verde, amarillo y rojo, por ejemplo, con variaciones en su diámetro entre 1 y 5 nanómetros.

El grupo de la Unicamp produjo puntos cuánticos desde 1989, pero en vidrios, con miras al desarrollo de dispositivos ultrarrápidos para comunicaciones ópticas. El trabajo con puntos cuánticos en soluciones empezó en la Unicamp en 1999, en un principio para efectuar una comparación con puntos cuánticos producidos en vidrio y, simultáneamente, en el Departamento de Química de la Universidad Federal de Pernambuco (UFPE).

Un estudio amplio
Actualmente, los trabajos científicos y académicos desembocaron en una colaboración más amplia con la UFPE, y en el IFGW trabajan los profesores Lenz y Luiz Carlos Barbosa, además de Selma Giorgio, de Biología, y Sara Saad y Fernando Costa, del Hemocentro, todos de la Unicamp. En la UFPE participan Ricardo Ferreira y Gilberto Sá, del Departamento de Química Fundamental, Beate Santos, de Farmacia, y Patrícia Farias, de Biofísica. También colaboran los docentes Vivaldo Moura Neto y Jane Amaral, del Departamento de Anatomía de la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ). La colaboración con la UFRJ comprende estudios con neuronas y neuroglias, que son células del cerebro, mientras que los estudios con el protozoario Leishmania amazonensis se llevan adelante en conjunto con el Instituto de Biología de la Unicamp. Las aplicaciones de las pinzas ópticas en la Unicamp se iniciaron en colaboración con el Centro de Hematología, con el equipo de la médica Sara Saad, para caracterizar las propiedades mecánicas de los hematíes, relacionándolas con enfermedades tales como la anemia falciforme, y con el tiempo de almacenaje en bancos de sangre (lea en Pesquisa FAPESP nº 58).

La integración de la pinza óptica con espectroscopías de uno o más fotones y con el uso de puntos cuánticos como marcadores unifica casi todas las técnicas más modernas de biofotónica en un sólo sistema, y abre a su vez varios nuevos campos de investigación. “Es un mar de posibilidades”, dice Lenz. “Son procesos biológicos que pueden observarse mediante el manipuleo de nivel celular. Un investigador estadounidense, por ejemplo, obtuvo un financiamiento de casi un millón de dólares para auxiliar a una industria de lácteos en la determinación, mediante el empleo de una pinza óptica, de las fuerzas mediante las cuales bacterias existentes en la leche se unen e a las paredes de envases tipo larga vida y cuánto tiempo permanecen allí. Con el sistema integrado es posible observar, además de las fuerzas, qué las sustancias se liberan en la leche”. Y todo eso sin matar a la bacteria o destruir las sustancias que se desea estudiar.

El Proyecto
Las pinzas ópticas y la espectroscopía
Modalidad
Centros de Investigación, Innovación y Difusión (Cepid, por su sigla en portugués)
Coordinador
Hugo Fragnito – IFGW, Centro de Investigación en Óptica y Fotónica (CePof) de la Unicamp
Inversión
1.000.000,00 de reales anuales para todo el CePof (FAPESP)

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