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Biotecnolog

Un dúo poderoso

Una enzima de mosca producida en levadura combate bacterias perjudiciales a la fabricación de alcohol combustible

Una pequeña proteína encontrada en la saliva y en la lágrima, llamada lisozima, mostró en laboratorio que es capaz de aumentar la eficiencia del proceso de producción de etanol con un considerable ahorro para las centrales, que ya manifestaron interés por la novedad biotecnológica. Para obtener estos resultados, investigadores de la Universidad de São Paulo (USP) produjeron una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae, el microorganismo responsable de la transformación del azúcar en alcohol combustible, capaz de fabricar esa proteína. De este modo, la levadura adquiere la capacidad de combatir las bacterias que contaminan las dornas donde se realiza la fermentación del jugo de la caña de azúcar, también llamado mosto. “El mosto constituye un óptimo sustrato para el crecimiento no sólo de la levadura, sino también de otros microorganismos, pues posee altos contenidos de nutrientes, además de presentar pH y temperatura favorables”, dice la profesora Ana Clara Guerrini Schenberg, del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (USP), coordinadora de la investigación. Además de competir por la sacarosa y otros nutrientes del mosto, las bacterias introducen en el proceso productos de metabolismo indeseables, principalmente ácidos orgánicos.

Los centrales normalmente adicionan antibióticos al mosto para combatir la contaminación bacteriana. Con el correr del tiempo, sin embargo, nuevos antibióticos o combinaciones de medicamentos son necesarios para dar cuenta de cepas de bacterias resistentes. Se estima que, para cada metro cúbico de etanol producido, son gastos de 3,00 a 5,00 dólares, como promedio, con antibióticos en los centrales. “Además del problema económico, hay el aspecto de polución ambiental, porque todo acaba yendo para la naturaleza, en la forma de efluentes que van para los ríos”, dice Ana Clara, especialista en genética molecular de microorganismos, que coordina en su laboratorio, en el Departamento de Microbiología, varios trabajos con levaduras y bacterias.

Sustancia antibacteriana – La búsqueda de un método alternativo al antibiótico para el control de los microorganismos presentes en la fermentación del etanol fue objeto de los trabajos de posgrado de Elza Grael Marasca y Luciano José Silveira bajo la orientación de Ana Clara. “Pensamos que, si la propia levadura contuviese un gen codificando una sustancia antibacteriana, ella misma resolvería el problema sin necesitar agregarle antibiótico al mosto”, iforma la coordinadora de la investigación, hija del renombrado físico teórico brasileño Mario Schenberg (1916-1990). Fue escogida para esa función la lisozima, una enzima que no es exactamente un antibiótico, sino que es altamente poderosa contra bacterias, pues degrada sus paredes celulares. “Es una proteína muy interesante, que es producida por prácticamente todos los seres vivos, pero  no por la levadura”, cuenta. En algunos procesos industriales, como conservación de alimentos, producción de vino y medicamentos, es utilizada una lisozima comercial, importada, extraída de la clara del huevo, en un proceso creado hace cerca de 40 años.

Antes de modificar la información genética de la levadura, los investigadores comenzaron a buscar en la literatura si había sido descrita alguna lisozima que soportase la acidificación del final de la fermentación alcohólica. En esa misma época, en 1996, la profesora Sirlei Daffre, investigadora del Departamento de Parasitología, que queda en el mismo edificio del Departamento de Microbiología, había acabado de llegar de Suecia, donde había desarrollado un trabajo sobre lisozimas de la mosca Drosophila melanogaster. “Por actuar en el trato digestivo de la mosca, esa lisozima presenta óptimo funcionamiento en pH ácido, semejante al encontrado en el proceso de fermentación alcohólica”, relata Ana Clara. El objeto de estudio de Sirlei eran los insectos y como ellos se defienden de las infecciones, investigación que acabó contribuyendo a la elaboración de un proceso tecnológico. “Ella había clonado el cADN de la lisozima, la parte del gene que interesa y es transformada en mensajero dentro de las células”, cuenta Ana Clara.

La cesión del gen clonado ayudó a acortar el camino, pero aún había mucho trabajo por delante. El paso siguiente era encontrar un promotor que hiciese que el  gen se expresase en la levadura, en un proceso llamado técnica de ADN recombinante, y garantizar que la lisozima fuese secretada para el medio de cultivo. Le cupo a Elza Marasca colocar el cADN de la drosófila bajo el control del promotor de la alcohol-deshidrogenasa 1, una enzima de la propia levadura utilizada durante el proceso de fermentación. Todo se encajó perfectamente. “Tanto el promotor como la levadura funcionan en perfecta sincronía durante el proceso de fermentación, mientras ocurre la producción de lisozima”, dice Ana Clara.

Fermentación alcohólica – Una vez hecho eso, era necesario verificar si el uso de la cepa de levadura recombinante productora de lisozima en procesos de fermentación alcohólica contribuiría a reducir el uso de antibióticos. Se sabe que la mayoría de los microorganismos presentes en las dornas son sensibles a la acción de la lisozima, que actúa preferentemente en la pared de bacterias Gram-positivas, como, por ejemplo, Bacillus coagulans y Lactobacillus fermentum. “Como en los centrales de alcohol del estado de São Paulo 98,5% de los contaminantes son bacterias Gram-positivas, en tesis es una óptima selección”, dice Gabriela Ribeiro dos Santos, cursante de posdoctorado que participa del proyecto. “Ahora tenemos que hacer un estudio mimetizando las condiciones encontradas en el central para evaluar, en la práctica, el efecto de la levadura modificada.” Para eso será necesario ajustar la cantidad de enzima secretada con la cantidad de contaminante existente en el proceso industrial.

Acción confirmada – El primer paso en ese sentido fue dado. Uno de los estudios hechos recientemente por el grupo de investigación consistió en inocular la cepa original de la levadura y la cepa que produce lisozima, para los efectos de comparación, en un mosto no estéril, como se utiliza en el central, pero realizado en el propio laboratorio de la USP. Un aspecto interesante en ese trabajo, que representa un avance para llegar al proceso industrial y resultó en una patente, bajo la gerencia de la Agencia USP de Innovación, es que la información genética de la lisozima fue estabilizada por medio de su integración en uno de los cromosomas de una cepa de levadura industrial utilizada por los centrales. “Vimos una diferencia muy significativa entre la cantidad de contaminantes en las condiciones originales con y sin lisozima”, relata Gabriela. Eso significa que la acción de la levadura recombinante sobre las bacterias fue confirmada en las pruebas, pero aún así los investigadores quieren aumentar la producción de la enzima para que ella responda satisfactoriamente a las condiciones enfrentadas a escala industrial.

La levadura modificada tiene solamente una copia del gene de la lisozima integrada a su cromosoma. “Ahora está siendo diseñada una estrategia para amplificar el número de copias del gene insertado en la levadura”, dice Ana Clara. “Como son conocidos algunos sitios cromosómicos de la levadura Saccharomyces cerevisiae que se prestan a inserciones de genes extranjeros sin enredar la vida de la cepa, podemos aumentar la capacidad de producción de lisozima sin interferir en la eficiencia de la producción de etanol.”

Todas esas modificaciones están siendo pensadas en función del interés de empresarios del sector sucro-alcoholero en la levadura modificada genéticamente. Para que ese interés sea concretizado, la primera etapa ya fue cumplida. Los investigadores sometieron la levadura modificada a la prueba de concepto, o sea, varias pruebas fueron realizadas para comprobar que ella funciona no sólo en las condiciones de laboratorio, sino también tiene potencial para ser empleada en el proceso industrial. “Concluimos esa prueba de concepto y pasamos en todos los prerrequisitos”, informa Gabriela. Los empresarios ahora quieren saber si en un futuro habrá problemas con la liberación del uso de organismos genéticamente modificados (OGMs) para la producción de etanol. “Vamos a efectuar una consulta sobre el tema ante la Comisión Técnica Nacional de Bioseguridad (CTNBio) para poder dar una respuesta”, dice Ana Clara.

Los estudios para la producción de etanol coordinados por la investigadora tuvieron su inicio durante los años de implementación del Proalcohol, el programa brasileño creado a finales de 1975. La idea era producir alcohol combustible a partir del almidón presente en la yuca, y no de azúcares simples, como la sacarosa y la glucosa encontradas en el jugo de caña. Sucede que la levadura Saccharomyces cerevisiae, cuyo nombre deriva de Sacaro, azúcar, y myces, hongo, consigue metabolizar la glucosa y la sacarosa, pero no el almidón, que es una molécula compleja con varias unidades de glucosa dispuestas en cadenas lineales y ramificadas. Esto significa que en todos los procesos involucrando sustratos amiláceos, como cebada, arroz, yuca o maíz, para producir etanol, hay necesidad de hacer un tratamiento enzimático previo.

Para abreviar la etapa de tratamiento previo del substrato y disminuir los costos del proceso de fermentación de amiláceos, el grupo de investigación dio inicio a un programa de mejoramiento genético de la levadura S. cerevisiae hace casi 25 años. “Fueron hecho varios trabajos para dotar la cepa de la levadura con la capacidad de degradar el almidón y procesar el azúcar de la yuca o mandioca en la fase de fermentación para transformarla en alcohol”, relata Gabriela, que se dedicó al asunto en su disertación de maestría. Como el almidón es una molécula ramificada, él necesita un complejo de enzimas amilolíticas para ser totalmente degradado.

Molécula compleja – La primera conquista hecha por el grupo, publicada en la revista Nature Biotechnology en 1986, fue conseguir que la levadura produjese y secretase para el medio de cultivo un gen que codifica la alfa-amilasa fabricada en el páncreas del pequeño ratón doméstico. La alfa-amilasa actúa sobre las cadenas lineales del almidón, rompiendo esa compleja molécula en moléculas menores, formadas por dos o más unidades de glucosa, de forma que la levadura aún desperdicia buena parte del azúcar contenido en el almidón. En un próximo paso del mejoramiento, Gabriela colocó el gene de una enzima más en la levadura, el de la glucoamilasa de otra especie de levadura. La glucoamilasa ayuda la alfa-amilasa a degradar al almidón y llevarlo hasta la molécula de glucosa. “Una ayuda la otra en ese proceso, pero el aprovechamiento aún no fue del 100%”, dice Gabriela. “En verdad, experimentos en escala piloto, realizados en el Departamento de Ingeniería Química de la USP, mostraron que el factor limitante de la eficiencia de fermentación era justamente la actividad de glucoamilasa”, completa.

Nuevas construcciones entonces se sucedieron para que la levadura pudiese expresar glucoamilasas más potentes y, encima de todo, de forma estable y en una levadura industrial. Hoy el laboratorio posee algunas cepas industriales recombinantes, de las cuales se destaca una que presenta el gene de la glucoamilasa en cinco copias. Las nuevas cepas deberán aún ser evaluadas en escala piloto, empleando el almidón de la yuca, una materia prima barata y abundante en Brasil, como fuente alternativa al azúcar proveniente de la caña.

Microorganismos programados para remover metales
Bacterias y levaduras capaces de remover metales pesados de los efluentes resultantes de la explotación minera están siendo producidas, con herramientas de la ingeniería genética, por el grupo de investigación coordinado por la profesora Ana Clara Guerrini Schenberg. El proyecto fue solicitado hace dos años y medio por la Companha Vale do Rio Doce, líder mundial en el mercado de mineral de hierro y segunda productora global de manganeso y aleaciones ferrosas. “Lo importante es encontrar un microorganismo adecuado para ejecutar determinada función”, dice Ana Clara. “Cuando ellos no funcionan exactamente como queremos, podemos mejorar las características de esos microorganismos.? Como la biorremediación de metales es un área nueva, el proyecto está dividido en varios subproyectos. 

Uno de los participantes, Ronaldo Biondo, está construyendo una bacteria que consigue unirse a los metales pesados para facilitar la tarea de removerlos de los efluentes de la explotación minera. Al mismo tiempo, la investigadora Gabriela Ribeiro dos Santos está construyendo un sistema suicida para esas bacterias para, cuando la tarea sea cumplida, ellas no causen riesgos a otros organismos presentes en la naturaleza. “Estoy trabajando en el desarrollo de un sistema genético que provoque la muerte de la bacteria, pero que, como una bomba reloj, sólo entre en acción después de cumplida la etapa de biorremediación por el microorganismo”, dice Gabriela.

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