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BiotecnologÍa

Anticuerpos para combatir plagas en el campo

Una empresa produce kits para diagnosticar enfermedades en plantaciones de soja y papa causadas por hongos y virus

Células híbridas utilizadas en la producción de anticuerpos monoclonales

EDUARDO CESARCélulas híbridas utilizadas en la producción de anticuerpos monoclonalesEDUARDO CESAR

Dos proyectos desarrollados por una pequeña empresa de biotecnología de Campinas, Rheabiotech, serán de ayuda para el control de las enfermedades en dos importantes cultivos agrícolas de Brasil. En dichos proyectos, se están produciendo anticuerpos en sus laboratorios que se utilizarán en kits cuya finalidad consiste en diagnosticar la roya asiática de la soja, causada por un hongo, y también dos tipos de virus que atacan a las plantaciones de papas. La roya asiática de la soja es una enfermedad causada por el hongo Phakopsora pachyrhizi, que ataca las hojas de la planta y provoca un deterioro en los granos con la consecuente caída de la productividad. Las pérdidas ocasionadas sumaron 25 mil millones de dólares en el período de 2003 a 2013, según la Confederación de Agricultura y Ganadería de Brasil (CNA). El control de la misma es complicado y requiere la aplicación constante de funguicidas, ya que en la fase inicial de infección, el hongo sólo puede detectarse mediante un examen visual con lupa. “El problema radica en que, como sólo se lo detecta luego de que la plantación se ha infectado, nunca se sabe exactamente cuándo se debe aplicar el funguicida”, explica el biólogo Luís Antônio Peroni, director asociado de Rheabiotech. “En función de esa incertidumbre se realizan varias aplicaciones ‒hasta seis o siete por cosecha‒, lo cual eleva los costos”. El kit que se está desarrollando en colaboración con la empresa ParteCurae Analysis, de São Carlos, permitirá un adelanto del diagnóstico de hasta cinco días, antes de que la contaminación se haya expandido.

Su fabricación comienza con la obtención de anticuerpos para el hongo. Para lograrlo, se utiliza como antígeno al micelio, que es la parte del tallo del hongo constituida por filamentos. Ese antígeno se inocula en conejos, cuatro veces en intervalos de 15 días, para inmunizarlos. Es decir, el organismo del conejo produce anticuerpos para combatir al antígeno. “Luego se extrae sangre del conejo, con esos anticuerpos, y de ella se obtiene el suero inmune”, explica la bioquímica argentina radicada en Brasil Fernanda Álvarez Rojas, directora asociada de Rheabiotech. “Después, se procede a la purificación de los anticuerpos”.

A esos anticuerpos obtenidos se los denomina policlonales, pues son producidos por diferentes clones de linfocitos B, células integrantes del sistema inmunitario. Son una mezcla de moléculas de inmunoglobinas producidas contra un antígeno específico, pero cada una reconoce una región distinta, también denominada determinante antigénico o epítopo. Actualmente, se encuentran disponibles en el mercado varios tipos de anticuerpos policlonales, producidos para test de diagnóstico o para combatir enfermedades infecciosas. Pero hay otro tipo de anticuerpos, denominados monoclonales, que se elaboran a partir de un único linfocito B, que son capaces de reconocer y combatir tan sólo una región del antígeno. Es decir, son más específicos y, por eso mismo, representan un gran avance para el tratamiento de varias enfermedades, principalmente el cáncer. El modo en que se los produce es distinto.

Incubadora donde se producen los anticuerpos

EDUARDO CESARIncubadora donde se producen los anticuerposEDUARDO CESAR

El paso inicial consiste en la inmunización de ratones con el antígeno y, a continuación, se les extrae el bazo, para obtener los linfocitos B o linfoblastos. Luego, esas células se mezclan con otras, cancerígenas, extraídas de un mieloma murino (de ratón). “Así obtenemos un conglomerado de células híbridas denominado hibridoma”, explica Peroni. “Éste tiene una capacidad de crecimiento ‘infinito’ en cultivo, conferida por las células cancerosas, y también la de producir anticuerpos, obtenidos de los linfocitos B del bazo del ratón. De esta manera, se pueden producir anticuerpos en laboratorio con una menor cantidad de animales”.

Según Peroni, la elección entre producir anticuerpos poli o monoclonales depende de las técnicas y del objetivo final. “Algunos antígenos son muy similares entre sí y, en esos casos, lo mejor es utilizar uno monoclonal, porque se puede realizar una selección de clones más específicos”, dice. “En general, cuando el objetivo del uso de los anticuerpos busca homogeneidad y producción en mayor escala, resulta interesante el uso de monoclonales, ya que al disponer del hibridoma se pueden producir los anticuerpos en cultivo y purificarlos. Además, esos anticuerpos siempre serán iguales a los originales, lo cual garantiza reproductibilidad y especificidad en el test”.

Con respecto al test para diagnosticar la roya asiática de la soja, la empresa puede emplear tanto los poli como los monoclonales. Para los que se han producido hasta ahora, empleando el método Elisa, se utilizaron ambos tipos de anticuerpos. El método Elisa es una técnica para análisis inmunológicos, capaz de detectar un antígeno o anticuerpo en una muestra, basándose en la interacción entre ellos. Si uno de ellos se encuentra presente, se produce una señal visible ‒tal como un cambio de color‒ que se detecta por medio de un espectrofotómetro. Pese a los buenos resultados que se obtuvieron con ese método en el diagnóstico de la roya asiática de la soja, en los test de campo realizados por Rheabiotech se presentaron algunos problemas. “Si bien es sencillo, esa clase de test requiere de una estructura mínima, constituida por una heladera, un lector de microplacas y un empleado capaz de interpretar los resultados, algo que normalmente no existe en la zona de las plantaciones”, dice Peroni. Por eso estamos desarrollando un kit diferente, que se vale de una membrana de nitrocelulosa, en forma de cinta, similar a un test de embarazo”.

freezer para la conservación del banco de células a -80ºC

EDUARDO CESARfreezer para la conservación del banco de células a -80ºCEDUARDO CESAR

Para eso, se firmó un convenio con ParteCurae Analysis, que interviene en los segmentos agrícola, ambiental, biotecnológico y veterinario, y elabora entre otros productos, kits de diagnóstico rápido para enfermedades de animales y plantas. En el caso del kit que se utiliza para detectar la roya asiática de la soja, se compone de una cinta que contiene anticuerpos en dos sectores definidos. “En uno de ellos se depositan los anticuerpos contra el antígeno en estudio (sector de test), en este caso, el micelio del hongo Phakopsora pachyrhizi”, explica la bióloga molecular Regiane Travensolo Sacomano, investigadora de ParteCurae. “En el otro se colocan los anticuerpos contra los ‘conjugados’ (sector de control)”. Ella explica que, en ese kit, los conjugados son anticuerpos secundarios, específicos contra los anticuerpos primarios, marcados con alguna enzima u otra sustancia que torne visible la reacción. En otras palabras, hay dos tipos de anticuerpos en el test. Los primarios, que reaccionan contra el antígeno, en este caso, el hongo. Y los secundarios, que contienen el marcador y reaccionan contra los primarios, otorgando visibilidad a toda la reacción. En el caso del kit desarrollado por ParteCurae, los marcadores que se utilizan son nanopartículas de oro.

Durante el diagnóstico, el complejo antígeno-anticuerpo conjugado migra por la membrana (la cinta) hasta llegar a las regiones de test y control. “Si aparecen dos líneas rojas, significa que el resultado es positivo, es decir, la muestra de hojas se encuentra contaminada con el hongo”, dice Travensolo. “Los análisis con resultado negativo indican tan sólo una línea roja, la de control, que es una forma de demostrar que el test funcionó en forma adecuada”. El diagnóstico se realiza en 10 minutos.

Graves daños
Por medio de un proceso similar, Rheabiotech está trabajando para desarrollar kits para la detección de dos tipos de virus que atacan a las papas, el virus X de la papa (PVX) y el virus Y de la papa (PVY), también denominados mosaico rugoso y mosaico severo de la papa, respectivamente. En esta ocasión, los anticuerpos policlonales contra los virus fueron desarrollados por el alumno de maestría Marcel Salmeron Lorenzi, bajo la supervisión de la profesora Dagmar Ruth Stach-Machado, del Instituto de Biología de la Universidad de Campinas (Unicamp). La empresa adquirió la licencia de esa tecnología, y ahora intenta transformarla en un producto comercial. En Brasil, el cultivo de la papa ocupa un área de alrededor de 130 mil hectáreas, con una producción de unos 2 millones de toneladas por año. En los últimos años, sin embargo, ha sufrido graves daños a causa de los virus PVX y PVY. “Causaron problemas en las hojas y manchas en las papas”, relata Peroni. Según Stach-Machado, se trata de un serio inconveniente. “En Brasil, las enfermedades provocadas por esos virus constituyen una de las principales limitaciones para el aumento de la producción”, dice.

Infografía: Ana Paula Campos / Ilustración: Alexandre AffonsoPara esos dos proyectos de producción del test para microorganismos específicos y para un tercero, de desarrollo de anticuerpos secundarios y conjugados, Rheabiotech recibió, entre 2004 ‒cuando su nombre todavía era Imuny‒ y 2014, alrededor de 1.300.000 reales de la FAPESP, por medio del Programa de Investigación Innovadora en Pequeñas Empresas (Pipe). En 2008, Peroni se asoció con Alvarez Rojas, fundadora de Imuny, y surgió Rheabiotech, con el objetivo de establecer un puente entre las investigaciones realizadas en las universidades y el mercado.

Proyectos
1. Desarrollo de kits diagnósticos para fitopatógenos de importancia para la agricultura (nº 2008/53621-4); Modalidad Programa de Investigación Innovadora en Pequeñas Empresas (Pipe); Investigador responsable Luís Antônio Peroni (Rheabiotech); Inversión R$ 386.992,10 (FAPESP).
2. Producción de anticuerpos para métodos inmunoquímicos – inserción en el mercado (nº 2012/51000-8 e nº 2013/50045-0); Modalidad Programa de Investigación Innovadora en Pequeñas Empresas (Pipe); Investigadora responsable Fernanda Alvarez Rojas (Rheabiotech); Inversión R$ 256.094,26 (FAPESP) y R$ 252.000,00 (Finep).

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