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Genética

Caçadores de genes

Domínio da técnica de chips de DNA pode facilitar diagnóstico de doenças como câncer de próstata

Com a ajuda de lâminas especiais de vidro com as dimensões aproximadas de um dedo indicador – os chamados microarrays ou chips de DNA -, o pesquisador Sergio Verjovski-Almeida, do Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ/USP), encontrou seis genes nunca antes descritos na literatura médica que podem estar relacionados com o câncer de próstata, o segundo tipo mais freqüente de tumor entre homens no Brasil, onde são registrados anualmente quase 21 mil novos casos da doença. Se ficar comprovada sua ligação com esse tipo de câncer, os genes, cujos nomes e localização ainda são mantidos em sigilo, podem se transformar em uma ferramenta importante para auxiliar o diagnóstico precoce da enfermidade ou a sua evolução clínica.

“Ainda temos de realizar mais estudos, com mais pacientes, para ter certeza da possível implicação desses genes com o câncer de próstata”, diz Verjovski, coordenador de um dos sete subprojetos do instituto que fazem parte do Cage (sigla em inglês que significa Cooperação para Análise de Expressão de Genes). Além de aprofundar as pesquisas com tecidos da próstata, o bioquímico faz um trabalho semelhante de procura de genes ligados ao câncer de pulmão.

O domínio de todo o processo de construção, experimentação e análise de microarrays – principal objetivo do Cage – permite confeccionar chips sob medida. Isso pode levar a resultados interessantes, ainda mais quando se tem a mão matéria-prima diferenciada para pôr nesses chips – genes ou potenciais genes ainda não estudados em relação a determinadas patologias ou situações. Esse foi o caso da equipe de Verjovski. Utilizando os equipamentos do laboratório de microarrays do Cage, inaugurado no Instituto de Química em dezembro de 2000, os pesquisadores construíram um chip de DNA inédito no mundo. Num microarray, onde cabem milhares de seqüências genéticas, depositaram 4 mil genes.

Metade desses genes já eram conhecidos, muitos deles com envolvimento em alguns tipos de câncer. A outra metade era composta por 2 mil ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas, regiões do genoma candidatas a serem genes), geradas pelo próprio instituto para o Projeto Genoma Humano do Câncer, iniciativa conjunta da FAPESP e da filial de São Paulo do Instituto Ludwig. Nessas 2 mil ESTs obtidas pela pesquisa genômica paulista e não disponíveis nos chips comerciais de DNA vendidos no mundo está um dos grandes segredos do bom resultado alcançado pelo microarray de Verjovski. “Dificilmente alguém no mundo tem um chip igual ao nosso”, afirma o pesquisador.

Detalhe importante: os chips e seus experimentos têm de ser feitos num ambiente extremamente asséptico e controlado, para não comprometer a confiabilidade dos dados. Para microarrays, a chamada sala limpa deve ter temperatura em torno de 22º C, umidade relativa do ar de 45% a 53% e no máximo 10 mil partículas de poeira por pé cúbico de ar, um padrão mil vezes mais severo que o de uma sala de operação esterilizada de hospital. “Montar e manter um laboratório desses não é uma operação trivial”, diz Hugo Armelin, também do Instituto de Química, coordenador geral do Cage. O laboratório de microarray pode fabricar simultaneamente 36 chips de DNA em quatro horas.Como se colocam genes numa lâmina? A descrição do que foi feito no Instituto de Química dá uma noção do processo.

Mantidos em freezers junto ao laboratório do Cage, clones das ESTs do Genoma Humano do Câncer foram amplificados por um método chamado PCR (reação em cadeia da polimerase) e, com a ajuda de um robô, depositados um a um em reservatórios microscópicos (na forma de um ponto ou circunferência) do chip. Algo semelhante foi feito com os outros 2 mil genes já conhecidos. Depois, material celular de tecidos normais e com câncer – retirados de 60 pacientes do Hospital Albert Einstein, de São Paulo, e do Hospital do Câncer do Instituto Nacional do Câncer, do Rio de Janeiro, com tumores de próstata em estágio intermediário – foram adicionados ao chip com 4 mil genes, num processo chamado hibridização. Os tecidos sadios foram marcados com corante fluorescente verde e os com câncer, de vermelho.

Feito isso, o microarray está pronto para fornecer indícios de quais genes são mais ou menos expressos (usados) por células sadias e pelas com tumores. Mede-se a expressão dos genes nos dois tipos de tecido com a ajuda de um scanner a laser e de softwares. O resultado são figuras como a publicada abaixo. Cada bolinha representa um gene. A cor verde significa que o gene em questão é mais expresso em tecido normal do que em tumores. O vermelho quer dizer o contrário. E o amarelo significa que a expressão é a mesma tanto num como em outro tipo de tecido. Depois de tratamentos e modelagens computacionais, a expressão dos genes nos dois tipos de tecido é comparada e analisada.

Toda célula de um organismo, normal ou com câncer, tem o mesmo DNA, os mesmos genes. Mas cada célula, de acordo com sua função e outros parâmetros, expressa (usa), com maior ou menor intensidade, certos genes em alguns momentos, enquanto os demais permanecem inativados. Portanto, apesar de disporem de DNAs iguais, uma célula normal exibe um padrão de expressão de genes distinto de uma célula tumoral. O uso de microarrays permite conhecer que genes são usados (e com que intensidade) em uma infinidade de situações.

Mamíferos e laranjas
Além do câncer de próstata, seis projetos do Cage trabalham com a tecnologia de chips de DNA, analisando a expressão de genes ligados a diferentes processos ou patologias em organismos distintos. Armelin, por exemplo, estuda o ciclo celular em mamíferos e, para isso, está desenvolvendo um microarray a partir de 33 mil ESTs de camundongos. Outro grupo, coordenado por Suely Lopes Gomes, conseguiu colocar em um chip mais de 90% dos cerca de 2.800 genes da bactériam Xylella fastidiosa, cujo genoma foi seqüenciado pela Organização para Seqüenciamento e Análise de Nucleotídeos (Onsa), rede de laboratórios criada pela FAPESP.

A meta principal dos pesquisadores é comparar a expressão de genes em distintas cepas da bactéria, que causa a Clorose Variegada dos Citros (CVC), a popular praga do amarelinho, nociva aos laranjais. “Vamos procurar entender por que uma dessas linhagens não pode ser modificada pela engenharia genética enquanto a outra aceita essas alterações”, diz Aline Maria da Silva, do Departamento de Bioquímica, que participa do subprojeto e é uma das responsáveis pelo laboratório de microarray. “Em um mês, devemos conseguir colocar todos os genes da Xylella no chip e ter a versão final do microarray.”

Outra iniciativa do Cage é construir chips de DNA para estudar a expressão genética de diferentes linhagens e estágios evolutivos do parasita Trypanosoma cruzi, protozoário causador da Doença de Chagas. O objetivo central do trabalho é, eventualmente, identificar genes ou conjuntos de genes que possam ser determinantes para o grau de severidade da moléstia. “Cerca de 60% dos portadores do parasita não desenvolvem a doença”, diz Bianca Zingales, coordenadora desse subprojeto, cujos primeiros resultados com microarray estão previsto para o próximo ano. “Mas 30% desenvolvem cardiopatias graves e outros 10% apresentam problemas digestivos.” Ainda no âmbito do Cage, há mais três subprojetos que estudam a expressão de genes em distintos microrganismos: a ameba Dictyostelium discoideum (cujos genes, embora em menor número dez vezes menor, são semelhantes ao conjunto de genes humanos), a bactéria Xanthomonas campestris (que provoca doenças em espécies vegetais) e a levedura Saccharomyces cerevisiae.

Programas
Por fim, o Cage conta ainda com a participação de um grupo de pesquisadores do Instituto de Matemática e Estatística (IME) da USP, que trabalha em sintonia com os pesquisadores da Química no desenvolvimento de uma série de bancos de dados, softwares e modelos computacionais para análise de expressão de genes em chips de DNA. É uma área estratégica dos estudos com microarrays, que geram uma quantidade enorme de informações e necessitam de programas e modelos matemáticos eficientes para realizar a chamada mineração de dados – separar o que é estatisticamente importante do que é secundário.

Há programas comerciais ou de domínio público que fazem isso, mas apresentam limitações. “Muitos são uma caixa-preta”, diz Junior Barrera, coordenador do Núcleo de Bioinformática do IME e membro do Cage. “Não sabemos exatamente como eles funcionam nem temos certeza do que medem.” Fora isso, alguns softwares requerem uma interação tão intensa do usuário que dois pesquisadores, usando o mesmo programa, podem chegar a resultados diferentes. Os bioinformatas paulistas, que já publicaram pelo menos três artigos em revistas internacionais em razão de seus trabalhos no Cage, estão tentando minimizar esses problemas. Em alguns casos, obtiveram bons resultados: em conjunto com colegas dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) dos Estados Unidos, criaram um software para visualização de imagens. Em breve, o programa estará disponível para download na página do NIH.

O Projeto
Cage – Cooperation for Analysis of Gene Expression (nº 99/07390-0); Modalidade Projeto temático; Coordenador Hugo Aguirre Armelin – Instituto de Química da USP; Investimento R$ 1.973.072,96

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