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TAPA

Un pez modelo

Más práctico y más barato que los roedores, comienzan a utilizar al llamado paulistinha en investigaciones neurocientíficas y pruebas de medicamentos en Brasil

Rellenando lagunas: originario de Asia, el paulistinha, zebrafish o pez cebra es un modelo animal intermedio entre la drosophila y los roedores

Léo RamosRellenando lagunas: originario de Asia, el paulistinha, zebrafish o pez cebra es un modelo animal intermedio entre la drosophila y los roedoresLéo Ramos

En el subsuelo del Museo de Ciencias y Tecnología de la Pontificia Universidad Católica de Rio Grande do Sul (PUC-RS), en Porto Alegre, funciona una agencia de encuentros algo infrecuente. Cada atardecer algunas parejas ‒tríos, en realidad‒ son conducidos a una sala silenciosa donde, a oscuras, pasan algunas horas conociéndose a cierta distancia. Por la mañana, cuando se encienden las luces y se les permite el contacto físico, los participantes inician un noviazgo de tan sólo 15 minutos que suele dejar muchos descendientes. Un letrero fijado del lado externo de la puerta mantiene alejados a los curiosos: “No ingrese: apareamiento en proceso”. En ese laboratorio de la PUC-RS, la bióloga Monica Ryff Moreira Vianna, siguiendo estrategias que ella misma optimizó, controla la reproducción de un pequeño pez rayado negro y plata conocido como pez cebra o paulistinha, que se utiliza cada vez más en las investigaciones en neurociencias en el mundo, y ahora, también en Brasil.

“En algunas pruebas, el pez cebra o zebrafish puede funcionar como alternativa al uso de roedores; en otras, puede aportar información complementaria”, sostiene el biólogo Denis Rosemberg, quien recientemente participó en la instalación de un bioterio de peces cebra en la Universidad Comunitaria de la Región de Chapecó (Unochapecó), en el estado Santa Catarina. Rosemberg comenzó a trabajar con el pez en el Laboratorio de Neuroquímica y Psicofarmacología, de la farmacóloga Carla Bonan, durante su carrera de grado en la PUC-RS. Investigó los efectos perjudiciales del alcohol sobre el cerebro y demostró la acción neuroprotectora de la taurina, un compuesto natural producido por el organismo y presente en las bebidas energizantes, cuando se trasladó a la Universidad Federal de Rio Grande do Sul (UFRGS).

En Santa Catarina, Rosemberg y el farmacólogo Angelo Piato empiezan actualmente a utilizar a este pez para investigar los efectos del estrés en el sistema nervioso central y en el comportamiento. Éste, por cierto, es uno de los casos en los que el zebrafish (Danio rerio) puede brindar ventajas sobre los roedores. Sucede que en el pez, la hormona que controla el estrés es el cortisol, la misma que liberan las glándulas suprarrenales en los seres humanos en situaciones reales o imaginarias de amenaza a la vida. En los roedores, la hormona producida en esos contextos es la corticosterona, que aparece en concentraciones muy bajas en el organismo humano.

En la UFRGS, el grupo del biólogo Diogo Losch de Oliveira logró dar un paso más allá. En el curso de un trabajo publicado al comienzos de este año en la revista PLoS One, Losch y su alumno de maestría Ben Hur Mussulini habían descrito minuciosamente las alteraciones de comportamiento que caracterizan a las fases epilépticas en el pez cebra adulto. “La literatura científica sólo registraba descripciones detalladas para el modelo en alevinos, que presentan un repertorio comportamental más acotado”, dice Losch.

Casi transparente: embriones de pez cebra 24 horas después de la fertilización

NATALIA ELTZ SILVACasi transparente: embriones de pez cebra 24 horas después de la fertilizaciónNATALIA ELTZ SILVA

Pero recientemente su grupo comenzó a testear los primeros de un grupo de 30 compuestos desarrollados en colaboración con Grace Grosmann, de la Facultad de Farmacia de la UFRGS. Estos compuestos apuntan a explorar una vía bioquímica distinta de las que constituyen el blanco de los medicamentos actualmente disponibles, incapaces de controlar alrededor del 30% de los casos de epilepsia. Entre los tres compuestos probados, tan sólo uno se mostró capaz de reducir la intensidad de las crisis y continuará durante las otras fases de evaluación.

Por cierto, existen estudios internacionales que consideran al pez cebra una herramienta bastante prometedora para el análisis y la selección de compuestos que pueden convertirse en medicamentos. Con este pez, se busca acelerar y abaratar el proceso. Una de las ventajas reside en su rápido ciclo de vida ‒varios de sus órganos están formados en cuatro días‒ y las larvas, que nacen por centenas con cada postura, siendo de unos pocos milímetros de longitud, pueden conservarse en varias cubetas con pequeñísimas dosis de compuestos químicos. Mediante tal selección, se cree que será posible reducir la cantidad de moléculas que seguirían para las fases posteriores, de experimentos con roedores. “Con los zebrafish se puede ensayar en meses y con algunos miles de dólares lo que demandaría años y costaría millones realizar con roedores”, comenta el bioquímico Diogo Onofre Souza, coordinador del Instituto Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación de Excitotoxicidad y Neuroprotección, donde se llevan a cabo las investigaciones con peces cebra en la UFRGS. En el exterior, algunas industrias farmacológicas han comenzado a adoptar el método en su línea de ensayos.

Pioneros
Nativo del sudeste asiático, donde se lo encuentra en ríos planos y apacibles y en las anegadas plantaciones de arroz y yute, este pez fue adoptado en los laboratorios de investigación a finales de los años 1960 por el biólogo estadounidense George Streisinger, de la Universidad de Oregon, quien trabajó en soledad durante una década para seleccionar linajes que permitiesen entender cómo los defectos en diferentes genes afectaban el desarrollo. Su esfuerzo sólo logró mitigar el escepticismo de sus colegas en 1981, cuando publicó un artículo en la revista Nature presentando el modelo consolidado. En los años siguientes, la cantidad de artículos científicos que utilizaban al pez como modelo biológico creció rápidamente, en especial en los estudios de genética y de desarrollo, y recién en la última década el pez cebra comenzó a utilizarse en neurociencia.

Casi transparente: larva con 5 días de vida

LAURA ROESLER NERYCasi transparente: larva con 5 días de vidaLAURA ROESLER NERY

Modelos Complementarios
“El pez cebra comienza a llenar la laguna que existía entre los modelos animales para el estudio de las enfermedades humanas”, dice el neurofisiólogo Luiz Eugenio Mello, de la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp), quien estudia las alteraciones en el sistema nervioso central, entre ellas las ocasionadas por la epilepsia, utilizando ratas como modelo biológico. Mello recuerda que un axioma de la ciencia expresa que el mejor modelo para investigar determinada cosa es la propia cosa. Siguiendo con ese razonamiento, lo ideal para el estudio de los males humanos serían los propios seres humanos. Pero ello raramente es posible. “En la mayoría de los casos existen restricciones éticas y limitaciones de tiempo, espacio y costo para realizar las investigaciones”, sostiene. “Por eso se necesitan varios modelos experimentales, desde los más simples hasta los más complejos, para comprender el origen de algunos problemas”.

Cuando no se puede investigar un problema en el propio ser humano, la medicina y la biología adoptan una especie de escala preferencial de modelos, en la cual se toman en cuenta factores tales como la semejanza evolutiva, anatómica, fisiológica y genética. Según este sistema, los animales que permitirían extrapolar los resultados con mayor fiabilidad a las personas serían otros primates, tales como el chimpancé, cuyo uso en investigación se encuentra prohibido en Brasil y se lo está desterrando en Estados Unidos, y otros monos. “Sólo trabajan con primates quienes dispone de gran presupuesto y espacio”, comenta el biólogo molecular João Bosco Pesquero, también de la Unifesp, y creador de uno de los primeros linajes brasileños de ratones transgénicos. “Por eso tantos optamos por los roedores, que son mamíferos, como los seres humanos”, dice.

Frente a las dificultades técnicas que impiden el trabajo con roedores, que es algo que a veces sucede en la genética ‒por ejemplo, sólo hace muy poco tiempo que se ha logrado producir ratones transgénicos‒, la solución radica en trabajar con modelos evolutivamente más alejados de los seres humanos, aunque más sencillos de manipularse, como son las drosophilas, las moscas de la fruta. Y, más recientemente, con el pez cebra.

Con todo, lo más importante desde el punto de vista evolutivo es que el pez cebra se encuentra más cerca del hombre que la drosophila, utilizada desde hace casi un siglo como organismo modelo en genética. El genoma del pez cebra, obtenido al comienzo de este año, indica que el 70% de sus 26 mil genes son similares a los genes humanos, una similitud que es menor en el caso de las moscas de la fruta y mayor en ratones y ratas, que sirvieron como base para mucho de lo que se conoce sobre la fisiología humana.

“Históricamente, las investigaciones en neurociencias utilizan a los roedores como modelo biológico, pero ese panorama está cambiando”, comenta Moreira Vianna, quien también integra el directorio de la Red Latinoamericana del Pez Cebra (Lazen). Este consorcio agrupa a investigadores de siete países que utilizan este pez en sus estudios y brinda capacitación a aquéllos que, generalmente en el inicio de la carrera, se muestran interesados en adoptar al pez cebra como modelo experimental. De los 39 grupos que integran la red, 11 son brasileños y casi la mitad de ellos se encuentran en Rio Grande do Sul.

La producción científica nacional que utiliza al pez cebra, inexistente hace poco más de una década, viene creciendo en forma acelerada durante los últimos años, a un ritmo mayor que en el resto del mundo. La bióloga Luciana Calabró, experta en cienciometría e integrante de uno de los grupos que realizan estudios con el paulistinha en la UFRGS, arribó a esa conclusión mediante un estudio reciente realizado en una de las mayores bases internacionales de artículos científicos, la Scopus. “La producción brasileña trepó de 2 artículos por año en 1999 a 36 en 2012, cuando pasó a representar alrededor del 2% de los trabajos con el pez cebra publicados en todo el mundo”, comenta.

La producción nacional con este pez aún es modesta frente a la internacional, que suma casi 2 mil artículos por año en los últimos tiempos. Pero está logrando destacarse en las neurociencias. “El pez cebra es un nuevo modelo en esa área y la comunidad que trabaja con él todavía es pequeña”, comenta Moreira Vianna.

En Brasil
Los primeros trabajos con este pez en Brasil salieron del laboratorio de la investigadora Rosana Mattioli, de la Universidad Federal de São Carlos (UFSCar) en el interior de São Paulo. En aquella época, el pez cebra comenzaba a utilizarse en las investigaciones en neurociencias, pero el comportamiento natural de la especie era aún poco conocido. Entonces Mattioli realizó una serie de experimentos sencillos que ayudaron a detectar la preferencia del pez por vivir en ambientes oscuros. Ella colocaba a los ejemplares de zebrafish en un acuario pintado de dos colores ‒la mitad negro y la otra mitad blanco‒ y registraba el tiempo que pasaban en cada una de las partes. Así pues, observó que éstos se quedaban la mayor parte del tiempo (alrededor de un 80% del mismo) del lado negro. También comprobó que, tan pronto como los colocaba en la parte clara, nadaban raudamente hacia el sector oscuro. Este trabajo, publicado en 1999 en el Brazilian Journal of Medical and Biological Research, comenzó a delinear la base de un importante test de ansiedad, perfeccionado inmediatamente por ella y otros investigadores, que se utiliza actualmente para evaluar el efecto de compuestos que combaten la depresión y la ansiedad.

Ansiedad
Al tomar conocimiento de este trabajo, el psicólogo Amauri Gouveia Junior, entonces en la Universidade Estadual Paulista (Unesp) en Bauru, notó una gran semejanza entre el test de claroscuro con zebrafish y un experimento que evalúa el nivel de ansiedad en roedores. En esta prueba, al roedor se lo coloca en una plataforma con forma de X a unos 60 centímetros del suelo. En dos de los brazos, el espacio para caminar está protegido por paredes, mientras que en los otros dos se encuentra abierto. Situadas en ese laberinto, las ratas, curiosas, evidencian tendencia a explorarlo. Pero evitan la parte abierta. Esa ansiedad deviene de un conflicto entre la curiosidad y el miedo. “El tiempo que los peces permanecían en el lado oscuro era muy similar a aquél en que los roedores se quedaban en la parte protegida del laberinto”, comenta Gouveia. “Por eso imaginé que ambas pruebas podrían medir la ansiedad en animales distintos”. Desde entonces, él aplicó el test claroscuro en 12 especies de peces, entre ellos el pez cebra, para evaluar la ansiedad en los peces. “Se trata de uno de los experimentos más utilizados actualmente en los laboratorios de estudio de peces en todo el mundo”, relata Gouveia, investigador de la Universidad Federal de Pará.

La fase siguiente consiste en probar compuestos que interfieren en ese comportamiento para intentar descubrir cómo lo alteran. Mediante algunos de esos test modelo, los investigadores brasileños han detectado alteraciones químicas y celulares en el cerebro, provocadas por crisis de epilepsia o por compuestos que controlan la depresión y la ansiedad. En la Universidad de Campinas (Unicamp), donde instaló un laboratorio de peces cebra hace dos años, la genetista Cláudia Maurer-Morelli y su alumna de maestría Patricia Barbalho notaron que los niveles de una molécula inflamatoria, la interleucina 1beta (IL-1β), aumentaron inmediatamente después de una crisis epiléptica inducida. Las crisis también elevan la producción y la actividad del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), una proteína que en los humanos se encuentra alterada en la epilepsia, tal como muestran los resultados publicados por Fernanda Reis-Pinto en 2012 en el Journal of Epilepsy and Clinical Neurophisiology. En una línea de investigación en su fase inicial, Maurer-Morelli contempla producir peces con las alteraciones genéticas que se encuentran en las personas que padecen epilepsia para investigar el rol que cumplen esas mutaciones en la enfermedad. El trabajo involucra al Instituto Brasileño de Neurociencias y Neurotecnología, uno de los Centros de Investigación, Innovación y Difusión financiados por la FAPESP y coordinado por Fernando Cendes.

Aunque los primeros trabajos con peces cebra hayan sido realizados en São Paulo, alrededor de la mitad de los artículos brasileños de los últimos años sale de equipos de Rio Grande do Sul, con una buena proporción en neurociencias. A juicio de Monica Vianna, una razón histórica explica la concentración de los trabajos brasileños con pez cebra en neurociencias. Tanto ella como Carla Bonan, de la PUC-RS, una de las primeras universidades en instalar un laboratorio de peces cebra en Brasil, habían realizado su capacitación en el grupo de Iván Izquierdo en la UFRGS, uno de los principales estudiosos de la memoria en el mundo. Luego de trabajar con roedores durante la maestría y el su doctorado, Bonan y Vianna resolvieron estudiar con zebrafish. En los últimos años, Bonan reveló que en esos peces, los niveles de algunas moléculas que actúan en la comunicación entre las células cerebrales ‒el trifosfato de adenosina y uno de sus componentes, la adenosina‒ desempeñan una función protectora contra la epilepsia, el estrés y la neurotoxicidad inducida por metales.

Reproducción
En la PUC-RS, Vianna y su equipo trabajaron durante meses hasta establecer la estrategia más eficiente para promover el apareamiento de los peces en el Laboratorio de Biología y Desarrollo del Sistema Nervioso. Ella sólo logró elevar la tasa reproductiva cuando reunió a los especímenes en grupos de tres (una hembra y dos machos) y los mantuvo separados mediante un divisorio transparente ‒los machos de un lado y las hembras del otro‒ durante toda una noche antes de que pudieran, finalmente, tener contacto. “Si no los separo, cada hembra produce menos de una docena de huevos”, relata la bióloga. En tanto, mediante el aislamiento, y transcurridas 12 horas de noviazgo a distancia, esa cantidad puede aumentar hasta alrededor de 200. Allí se producen unos diez apareamientos por día y nacen, en promedio, 2 mil crías por mes. Durante una mañana excepcionalmente productiva, en mayo de este año, Vianna y su equipo se pasaron horas recogiendo uno por uno, con una pipeta, los alrededor de 1.800 embriones que resultaron de un único apareamiento de algunas decenas de tríos de pez cebra, a los que ella está utilizando para investigar la bioquímica de la memoria y de las enfermedades neurodegenerativas tales como el mal de Alzheimer.

Como se estima que la demanda por ejemplares del pez pueda crecer en los próximos años, los grupos de Vianna, Bonan y los colegas que comparten el bioterio de la PUC-RS trabajan para ampliarlo. Sucede que los 5 mil peces que actualmente hay allí resultan apenas suficientes para abastecer los estudios llevados adelante por ellos y algunos colaboradores. El objetivo es convertir a esos laboratorios en uno de los principales proveedores de peces cebra para investigación en Brasil, junto al del Laboratorio Nacional de Bioceincias (LNBio), en Campinas, donde el equipo del biólogo José Xavier Neto instaló el año pasado un bioterio para producir paulistinhas con alteraciones genéticas para el estudio del desarrollo de los vertebrados. Comparando el desarrollo embrionario de peces, gallinas y ratones, el equipo de Xavier Neto comenzó a dilucidar en los últimos años el rol de algunos factores involucrados en la diferenciación del corazón de los vertebrados y en el desarrollo de neuronas sensoriales.

Uno de los motivos que inciden para el aumento de la producción de estos peces se basa en su mercado potencial. La Ley Arouca, que reglamenta el uso de animales en investigaciones, establece que a partir de 2014 deberán utilizarse ejemplares con su origen, calidad y uniformidad certificados. “En principio”, dice Vianna, “ya no se podrá investigar con peces comprados en tiendas de animales”.

Artículos científicos
MUSSULINI, B.H. et al. Seizures Induced by Pentylenetetrazole in the adult zebrafish: a detailed behavioral characterization. PLos One. v. 8. Ene. 2013.
REIS-PINTO, F. C. et al. Análise temporal dos transcritos dos genes bdnf e ntrk2 em cérebro de zebrafish induzido à crise epiléptica por pentilenotetrazol. Journal of Epilepsy and Clinical Neurophysiology. v. 18, n. 14, p. 107-13. 2012.
CASTILLO, H. A. et al. Insights into the organization of dorsal spinal cord pathways from an evolutionarily conserved raldh2 intronic enhancer. Development. v. 137, p. 507-18. 2010.