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MICROBIOLOGÍA

Para la gente y para las plantas

Un medicamento expectorante podría ser eficaz para el control de la plaga de los naranjos

Xilema (verde) colonizado por Xylella fastidiosa

ALESSANDRA DE SOUZA / IACXilema (verde) colonizado por Xylella fastidiosa ALESSANDRA DE SOUZA / IAC

Mientras le suministraba jarabe expectorante a su hijo engripado, la bióloga Alessandra de Souza tuvo una idea: ¿podría utilizarse ese medicamento para tratar la enfermedad de los naranjos por la que se desvela en su ámbito profesional? La inspiración es menos insólita de lo que parece cuando se vislumbran simultáneamente los síntomas de la gripe en un niño y la anatomía de un naranjo. Esto sucede porque la bacteria Xylella fastidiosa, causante de la clorosis variegada de los cítricos (CVC), también conocida en Brasil como la plaga de amarelinho, por las manchas amarillas que deja en las hojas y frutos, invade la planta formando una biopelícula que unifica a la comunidad de microorganismos invasores. La ruptura de ese biofilme ni bien comienza a formarse podría ser la mejor forma de combatir la enfermedad, que ocasiona graves pérdidas en la producción nacional de naranjas, sostiene la bióloga Marie-Anne Van Sluys, de la Universidad de São Paulo (USP), en un reportaje publicado en la Edición Especial 50 años de la FAPESP. Ése, por cierto, es el objetivo de Alessandra de Souza, investigadora del Centro de Citricultura Sylvio Moreira del Instituto Agronómico de Campinas (IAC), con sede en Cordeirópolis, en el interior paulista.

Y De Souza parece hallarse en el camino correcto, según lo indican los resultados obtenidos en la maestría por su alumna Lígia Muranaka, publicados este año en la revista PLOS ONE. “La patogenicidad de la Xylella se encuentra próxima a la de las bacterias que causan infecciones en los seres humanos, con expresión génica y mecanismos similares”, afirma De Souza. Por eso, ella ya probó varios tipos de antibióticos, tales como la tetraciclina y la neomicina. “La Xylella es susceptible a esos medicamentos”, comenta, “pero resultan muy caros para utilizarlos en la agricultura”. La investigadora explica que la formación de la biopelícula dentro de la planta permite a las bacterias comunicarse entre sí, comportándose como un organismo único. Esa peculiaridad acaba obstruyendo los vasos del xilema, donde los microorganismos se alojan, e impide el paso de nutrientes y agua desde las raíces hacia la copa de los árboles. Si ése es el mecanismo de acción de la enfermedad, tal vez allí mismo se pueda hallar una solución económicamente factible y sin impactos ambientales.

La N-acetilcisteína (NAC), el principio activo del jarabe que De Souza le dio a su hijo, un viejo conocido para quienes comúnmente padecen problemas respiratorios, es un agente mucolítico, es decir, disolvente del moco. “Ese compuesto destruye el biofilme y desestructura las proteínas de varias bacterias que infectan a los seres humanos, tales como Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis y Pseudomonas aeruginosa”, comenta. Nunca se había utilizado ese fármaco en plantas, pero sabiendo ‒a raíz de estudios del genoma funcional‒ que muchas de las proteínas que propician la adhesión entre las bacterias X. fastidiosa en el interior del naranjo forman uniones entre sí gracias a la cisteína, su equipo partió del supuesto de que esa medicina podría resultar eficaz para combatir la clorosis.

Bacterias vivas, con la mutación fluorescente, bajo el microscopio confocal

RICHARD JANISSEN / UNICAMP, MICROSCÓPIO INFABICBacterias vivas, con la mutación fluorescente, bajo el microscopio confocalRICHARD JANISSEN / UNICAMP, MICROSCÓPIO INFABIC

En el naranjal
En los experimentos in vitro dio resultado, pero una cosa es la teoría o el trabajo con cultivos de bacterias en recipientes de vidrio en el laboratorio y otra muy distinta aplicar ese conocimiento en las bacterias activas en los naranjales. En el primer experimento en plantas vivas, el grupo de De Souza aplicó NAC en naranjos mantenidos en un sistema hidropónico, donde las raíces quedan directamente expuestas a la medicación. Los resultados fueron prometedores: la cantidad de hojas con manchas amarillas y la cantidad de bacterias disminuyeron en las plantas tratadas. Sin embargo, para mantener el control, se necesitaba administrarle a la planta el medicamento casi en forma permanente. Si se lo discontinuaba, en tres meses reaparecían los síntomas.

Un experimento más realista (“al fin de cuentas, los naranjos no crecen en hidroponía”, recuerda De Souza), donde se irrigó a las plantas con una solución que incluía NAC y, en algunos casos, se les inyectó el fármaco en las raíces, obtuvo resultados similares. Pero el efecto mucolítico era lo suficientemente prometedor para que el equipo, que también incluía a investigadores de la Universidad de Campinas (Unicamp) y de la Universidad Federal de São Carlos (UFSCar), buscase una manera más eficaz de aplicarlo.

“Establecimos una colaboración sin fines de lucro con una empresa de fertilizantes orgánicos”, comenta De Souza. El fabricante, Agrolatino, desarrolló una fórmula para incorporar NAC en el fertilizante granulado, de modo tal que la liberación del medicamento sería gradual. En este caso, los síntomas se redujeron todavía más y durante un tiempo más prolongado, de alrededor de ocho meses posteriores a la aplicación. Esa solución podría ser viable para controlar la clorosis variegada de los cítricos en plantaciones reales, pero De Souza aún cree que existe potencial para mejorarla. “Estamos estudiando cómo hacer para que la liberación sea aún más lenta, utilizando NAC nanoencapsulado”. Es necesario evaluar la eficacia en campo de ese tipo de tratamiento, por eso se lo está probando en colaboración con el sector citrícola.

Dentro del xilema
La trayectoria que está recorriendo De Souza se inicia con la ambiciosa iniciativa que secuenció el genoma de la X. fastidiosa (lea en la Edición Especial 50 Años de la FAPESP), cuando ella recién había culminado su maestría y comenzó a trabajar en el IAC junto a Marcos Machado, coordinador de uno de los grupos de trabajo del proyecto en el que la FAPESP invirtió 12 millones de dólares y se transformó en un ejemplo de la madurez de la comunidad científica brasileña. Ella es una de los 116 autores del artículo publicado en la revista Nature en julio de 2000 con los resultados del primer proyecto genómico del país y se basó en esos resultados para en su tesis doctoral, en la cual investigó los genes implicados en la patogenicidad y la formación de biofilme en esa bacteria. De allí surge el título de la conferencia que presentó en el Congreso Brasileño de Fitopatología, realizado en la localidad de Ouro Preto en octubre de este año. “El genoma de la Xylella fastidiosa: 13 años después del ‘momento de gloria’, ¿dónde estamos?”. Una breve respuesta indica que la inversión en un emprendimiento controversial, centrado en un organismo hasta entonces más famoso (por lo malo) entre los productores de naranjas que entre los científicos, no cesa de rendir frutos. Y continúa ramificándose en diversas áreas de la ciencia.

Mientras ensaya en la práctica cómo controlar la enfermedad, que es la pesadilla de los citricultores y que en 2009 todavía afectaba al 35% de los naranjales, idéntica cifra que la registrada una década antes, De Souza halló en el campo de la física nuevos colaboradores para obtener una comprensión más pormenorizada acerca de cómo genera la X. fastidiosa la biopelícula que le permite infectar a las plantas. La investigación conducida por Mônica Cotta, de la Unicamp, es independiente de la que se realiza en el IAC, pero complementaria. “Ahora contamos con un modelo de adherencia completo, que nos permite comprender lo que hace la Xylella en cualquier superficie”, relata. La escala es muy diferente, en comparación con los naranjales donde investiga De Souza. La principal herramienta de trabajo de la física está constituida por microscopios sofisticados, tales como el de fuerza atómica y el confocal con spinning disk, este último, con sede en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Fotónica Aplicada a la Biología Celular (Infabic), coordinado por Hernandes Carvalho, de la Unicamp.

Los frutos de las plantas afectadas son de menor tamaño

HELVECIO DELLA COLETTA FILHO / IACLos frutos de las plantas afectadas son de menor tamañoHELVECIO DELLA COLETTA FILHO / IAC

Con esos aparatos, el grupo de Cotta logra observar cómo se comportan las bacterias en diferentes superficies, fundamentalmente en lo referente a la formación de la biopelícula. Ella está a punto de responder la pregunta fortuita que De Souza le formuló cuando se conocieron, en 2007: ¿por qué permanecen “de pie” al final del ciclo de cultivo en el laboratorio, transcurridos 30 días? Se trata de pequeños bastones cilíndricos, y de hecho, quedan apoyados sobre uno de sus extremos en determinadas situaciones; pero lo que importa, por ahora, es que el abordaje físico reveló que el cultivo de esas bacterias en placas de vidrio para su observación en el microscopio electrónico no resulta suficiente como para comprenderlas, puesto que las condiciones en que viven plantean grandes diferencias.

Cotta hizo valer su expertise en microscopía y utilizó sustratos más parecidos al que se hallan en la naturaleza ‒dos tipos de celulosa‒, además del vidrio. “En primera instancia, la bacteria se adhiere, luego secreta los exopolisacáridos que forman una cápsula y, a continuación, la biopelícula”, explica. Un artículo publicado en septiembre en la revista PLOS ONE, que es la parte principal del doctorado de Gabriela Lorite, que integra su equipo, revela que el sustrato provoca importantes variaciones tanto en el formato del biofilm como en sus bordes. “A la bacteria le agrada el silicio y no le gusta la celulosa”, comenta la física, quien erigió su trayectoria en el estudio de materiales y parece haberse aficionado al organismo que la acercó al mundo biológico. De los dos tipos de celulosa que produjo en el laboratorio, el acetato de celulosa es más rugoso y menos cómodo para la Xylella, que no logra expandirse por toda su superficie. En tanto, la etilcelulosa presenta menor irregularidad, y ahí la bacteria se adhiere mejor. “Son diferentes tipos de rugosidad, como si comparáramos los Alpes con Serra da Mantiqueira”, dice.

Adherencia física
Pero la rugosidad no es la variable más determinante para la adherencia, y las técnicas acopladas en la microscopía permiten manipulaciones muy minuciosas para describir ese proceso. Cotta logra, por ejemplo, sujetar en la punta del microscopio de fuerza atómica una proteína que produce la Xylella al inicio del ciclo infeccioso. Al punzar las bacterias con esa sustancia, los investigadores las inducen a la adherencia y miden la fuerza de la interacción entre el organismo y el sustrato. “Comprobamos que a las bacterias les agradan más algunas zonas que otras”. Los experimentos indican que en el silicio y en la etilcelulosa, al menos una de las proteínas se adhiere casi siempre al sustrato. No sucedió lo mismo con el acetato de celulosa, donde dicha adherencia sólo se observó en un 20% de los casos. La conclusión más general del trabajo determina que la Xylella posee una tendencia mayor a fijarse en superficies eléctricamente más uniformes, con carga positiva, que además son hidrófilas (atraen al agua).

Con los estudios realizados hasta ahora por el grupo de Cotta se comienza a comprender en qué manera la biopelícula se instala y se difunde por el xilema de los naranjos. Sacando provecho de la característica que le da su nombre a la bacteria y que permite observar su dinámica en tiempo real ‒es fastidiosa en el sentido de su lentitud enervante‒, Cotta tiene varios planes en vista. Entre ellos se incluye estudiar mejor cómo la expresión génica influye en la formación del biofilme, utilizar el brillo que le confiere la proteína fluorescente verde (GPF, según su sigla en inglés) para observar su dinámica y, en consonancia con el trabajo de De Souza, mejorar la comprensión del efecto de la NAC sobre las propiedades de la biopelícula en el curso de su formación y su desarrollo. Esto permitirá investigar minuciosamente la sospecha de Van Sluys, que estima que las fases iniciales de la infección resultan cruciales.

Lesiones típicas causadas por la CVC en las hojas

ALESSANDRA DE SOUZA / IACLesiones típicas causadas por la CVC en las hojas ALESSANDRA DE SOUZA / IAC

La mayor resolución con la que trabajan los físicos ayuda incluso a redefinir las instancias iniciales desde un punto de vista experimental. Cuando Cotta le dijo a De Souza que ya podía detectarse el fiofilme, aunque con pocas bacterias, seis horas después de la inoculación de la bacteria en el medio de cultivo, la bióloga no le dio mucho crédito a esa información. Al fin y al cabo, ella sólo lograba divisar un conjunto de bacterias a partir de cinco días de incubación.

Cotta subraya que los avances obtenidos sólo son posibles gracias a una interacción permanente, aunque esporádica, entre biólogos y físicos. Como dijo uno de sus alumnos, luego de una visita al IAC: “Piensan distinto”. Ese pensar diferente es lo que genera nuevas preguntas, nuevos enfoques, y permite hallar respuestas innovadoras. Ella opina que el uso de equipamientos multiusuarios, en los que la FAPESP invierte bastante, es clave en este sentido. “Aprendimos a interactuar con otras áreas, no sólo a utilizar el equipamiento”.

Otra peculiaridad que la física de la Unicamp cree que es relevante, consiste en que ambos laboratorios son dirigidos por mujeres. “Y charlatanas”, añade. Las conexiones que rindieron frutos surgieron en conversaciones durante el almuerzo, en las cuales quedaron expuestos los intereses en común y se estrecharon las relaciones de trabajo. Además, también se suma el hecho de que ambas hacen malabares constantemente para equilibrar la vida personal y la vida profesional, la maternidad, las amistades y las colaboraciones. “Las ideas surgen de la experiencia”, resalta Cotta, recordando la inspiración inicial de su colega al darle el jarabe a su hijo.

Proyectos
1. Características biológicas de la Xylella fastidiosa en el biofilme: la importancia de los genes de adherencia y la adaptación en la patogénesis (2004/ 14576-2); Modalidad Programa Joven Investigador; Coord. Alessandra Alves de Souza/ IAC; Inversión R$ 205.432,59 (FAPESP)
2. Análisis estructural y químico de biopelículas de Xylella fastidiosa (2010/ 51748-7); Modalidad Línea Regular de Ayuda al Proyecto de Investigación; Coord. Mônica Alonso Cotta/ Unicamp; Inversión R$ 187.405,53 (FAPESP)

Artículos científicos
MURANAKA, L. S. et alN-Acetylcysteine in agriculture, a novel use for an old molecule: focus on controlling the plant-pathogen Xylella fastidiosaPLoS One. v. 8, n. 8, e72937. ago. 2013.
LORITE, G. S. et alSurface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm developmentPLoS One. v. 8, n. 9, e75247. set. 2013.

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