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Genética

Mutação mapeada

Trabalho internacional coordenado por pesquisador brasileiro indica gene causador de uma grave doença de rim em crianças

Num artigo publicado on-line em 15 de março no American Journal of Human Genetics, uma das mais respeitadas revistas da área de genética, o pesquisador Luiz Fernando Onuchic, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP), em colaboração com 17 colegas dos Estados Unidos e Europa, identifica e descreve, com riqueza de detalhes, o gene que, quando alvo de mutações em suas duas cópias, desencadeia uma severa e rara enfermidade hereditária principalmente em recém-nascidos e crianças, a doença renal policística autossômica recessiva.

Trata-se do gene PKHD1 (sigla em inglês para Polycystic Kidney and Hepatic Disease 1), um enorme e complexo gene, localizado no cromossomo 6, que produz um provável conjunto de proteínas até então desconhecidas, batizadas pelos autores do estudo de poliductina. “Esse gene está implicado em todas as formas típicas da doença”, diz Onuchic, cujo nome aparece à frente dos demais pesquisadores por ter sido o brasileiro o principal responsável pela descoberta do gene. “Encontramos diferentes mutações nesse gene que podem levar à doença.”

Além do cientista da USP, cujos estudos são financiados pela FAPESP, o grupo que participou do trabalho – na verdade, um consórcio internacional – inclui pesquisadores de quatro universidades dos Estados Unidos (Johns Hopkins, Yale, do Alabama em Birmingham e Case Western Reserve) e uma da Alemanha (Universidade Técnica de Aachen). “A identificação do gene responsável por esse problema hereditário é um marco e abre as portas para a descoberta de uma cura para a doença”, comenta Gregory Germino, da Universidade Johns Hopkins, líder do consórcio. “Agora, podemos começar a desenvolver um teste de DNA que provavelmente poderá ser usado para identificar potenciais portadores (do gene mutado) ou indivíduos afetados.”

Neste mês, o estudo do grupo – que já entrou nos Estados Unidos com o pedido de patente do novo gene e das proteínas que ele produz – sai na edição impressa do American Journal of Human Genetics. Numa tendência dominante nos grandes periódicos científicos, que competem pelos melhores trabalhosdos pesquisadores, o artigo de Onuchic e seus colegas foi publicado eletronicamente, de forma antecipada, pela revista norte-americana devido ao seu alto impacto, por trazer um achado muito importante. E também porque um grupo concorrente de pesquisadores da Clínica Mayo, Estados Unidos, publicara, inicialmente também on-line, em 4 de fevereiro, um artigo dando conta igualmente da descoberta do PKHD1 na revista britânica Nature Genetics.

Um detalhe precisa ficar claro nessa história: o grupo do qual o brasileiro faz parte submeteu seu artigo à apreciação do American Journal em 1º de fevereiro, antes de a Nature Genetics publicar eletronicamente o estudo dos cientistas da Clínica Mayo. Na prática, as duas equipes, que trabalharam de forma independente, com estratégias distintas, chegaram simultaneamente ao mesmo resultado. “A comunidade científica entende as particularidades da ciência competitiva e está dividindo o crédito dessa descoberta entre os dois grupos”, afirma Onuchic.

A existência da doença renal policística autossômica recessiva, que afeta os rins e o trato biliar, é ignorada pela maioria das pessoas devido à sua baixa incidência na população. Conhecida em inglês pela sigla ARPKD, a enfermidade acomete um em cada 20 mil nascidos vivos. Num país como o Brasil, onde anualmente cerca de 3 milhões de bebês deixam a sala de parto com vida, isso equivale a dizer que 150 novos casos da doença são esperados a cada 12 meses. Em até metade das ocorrências, as crianças que nascem afetadas pela ARPKD morrem logo após o parto. E até 20% dos portadores dessa enfermidade não alcançam os 5 anos de idade, e não há nenhum tratamento específico que impeça ou controle o desenvolvimento da doença.

Rins dilatados
Os rins das crianças que, ao nascer, apresentam a forma severa da doença mostram-se aumentados, com um peso até dez vezes maior do que o normal e dilatações císticas nos dutos coletores, segmentos das estruturas funcionais desse órgão. “Numa criança de 2 anos de idade com a doença, acompanhada em nosso hospital, os rins atingiram um comprimento de cerca de 15 centímetros, enquanto o normal seria em torno de 6 centímetros”, comenta Onuchic. Os doentes que sobrevivem ao período inicial da vida têm uma evolução clínica variável. Entre as principais causas de piora clínica e óbito nesses pacientes figuram hipertensão arterial severa, problemas hepáticos e progressiva perda de função renal.

Aproximadamente metade dos atingidos perde completamente a função dos rins antes dos 10 anos de idade. Nesses casos, as crianças passam a depender de diálise ou de um transplante de rim para permanecer vivas. “Como não há tratamento específico para a doença, apenas cuidamos das complicações e oferecemos terapêutica de suporte ao paciente, para controlar, na medida do possível, as manifestações da doença”, comenta o pesquisador. No Instituto da Criança do Hospital da Clínicas de São Paulo são acompanhados atualmente 25 casos da doença.

Até a descoberta do PKHD1, a medicina sabia que a doença era causada por defeitos em apenas um dos cerca de 30 mil genes presentes no genoma humano, mas não havia conseguido precisar qual deles era a causa do problema. Outra característica da enfermidade que era de domínio público: a doença, como seu próprio nome deixava claro, era recessiva. Para que desenvolvesse a enfermidade, uma criança tinha de herdar as duas cópias defeituosas do então misterioso gene que causava a ARPKD. Quem tinha apenas uma cópia do gene com problema não desenvolvia a doença, embora pudesse transmiti-la a seus filhos se seu parceiro também carregasse uma mutação nesse mesmo gene. Como se sabe, todo ser humano tem duas cópias de cada um dos seus genes localizados nos cromossomos não sexuais, uma herdada do pai e outra, da mãe. Tudo isso já era conhecido pela ciência há tempos. Faltava, no entanto, localizar o tal gene alterado na doença, o que somente aconteceu agora.

O primeiro grande avanço na busca da raiz genética da ARPKD ocorreu em 1994, quando pesquisadores alemães mostraram que o gene implicado na doença encontrava-se numa região do cromossomo 6. Foi um primeiro avanço, mas limitado. Afinal, essa região era um segmento genômico bastante grande, que incluía um número enorme de genes, alguns conhecidos, outros não. No ano seguinte, embalados por esse primeiro achado, o grupo chefiado por Germino na Universidade Johns Hopkins, onde Onuchic trabalhava na ocasião, montou o consórcio internacional que viria a decifrar a causa genética da doença sete anos mais tarde.

Fechando o foco
O feito foi conseguido com o auxílio de uma estratégia conhecida como clonagem posicional, abordagem freqüentemente utilizada para se descobrir genes relacionados a doenças complexas, cujo defeito bioquímico primário, que ocasiona o problema clínico, é desconhecido. Esse era o caso da ARPKD. Os pesquisadores da Clínica Mayo, sob a coordenação de Peter Harris, usaram uma abordagem diferente para identificar o gene da doença – acharam o PKHD1 a partir de um modelo de doença renal policística recessiva desenvolvido espontaneamente em ratos. Algumas das características desse modelo eram semelhantes às da doença humana.

Em que consiste a clonagem posicional? Primeiro, os cientistas têm de descobrir em que região de um cromossomo o gene causador da doença em questão se encontra. Isso é feito com o emprego de um método chamado análise de linkage e redução progressiva do intervalo de interesse. Os pesquisadores tanto identificam genes, em laboratório, quanto buscam em bancos de dados internacionais os que, pela sua estrutura ou função, exibam o potencial de abrigar mutações que possam causar a doença.
Por fim, é preciso mostrar que mutações levam ao problema clínico (encontrar mutações desse gene no DNA de pacientes com a ARPKD). Portanto, com a estratégia da clonagem posicional, o cerco ao gene ligado a uma doença vai se fechando até que sobrem poucos suspeitos. É um processo que exige paciência, concentração e que pode demorar anos. “É mais ou menos como tentar descobrir numa população predeterminada quem é o bandido que cometeu um crime”, compara Onuchic.

No caso do PKHD1, os estudos anteriores do consórcio indicavam que o gene mutado na doença renal policística autossômica recessiva estava numa região do cromossomo 6 que se estendia por 834 mil pares de base, onde, depois de uma minuciosa análise, os cientistas chegaram a várias seqüências expressas suspeitas. Entre elas, uma que os pesquisadores do consórcio conseguiram demonstrar ser o tão sonhado gene associado à doença, o PKHD1.

A caracterização desse gene, enorme e complexo, mostrou que ele se estendia ao longo de um segmento genômico de cerca de 470 mil pares de base e que se expressava principalmente no rim, o órgão mais afetado pela enfermidade. “No início desse processo, não sabíamos se seqüências expressas que fazem parte desse gene pertenciam a um ou a dois genes”, conta Onuchic.

Estudos posteriores revelaram que se tratava de um único gene. A prova deque esse gene era o relacionado à ARPKD foi fornecida por uma evidência produzida por Onuchic e seus colegas. Os pesquisadores procuraram – e encontraram – mutações potencialmente patogênicas no gene PKHD1 pertencente a 21 cromossomos de pacientes com a doença renal policística autossômica recessiva. Essas mutações, que foram localizadas em diferentes partes do gene, não estavam presentes em 120 cromossomos de pessoas sadias, o chamado grupo controle.

De quebra, durante esse cerco à origem molecular da ARPKD, os pesquisadores acabaram descobrindo outro gene novo, que nunca havia sido descrito na literatura científica e não guardava nenhuma relação com a doença renal. Chamado de ML-1, esse novo gene parece participar da resposta inflamatória alérgica da asma, um problema de saúde bastante freqüente. O relato de sua identificação foi publicado numa edição do final do ano passado do Journal of Immunology. O ML-1 agora é alvo de estudos conduzidos pelo setor de imunologia da Universidade Johns Hopkins.

Além de ser o gene causador dessa rara enfermidade que vitima principalmente bebês e crianças, o PKHD1 também pode ajudar a ciência a compreender um pouco melhor certos mecanismos relacionados ao genoma humano. Há indícios que embasam esse caráter, digamos, didático e revelador do novo gene. O tamanho genômico (espaço ocupado no cromossomo) do PKHD1 o torna um dos maiores genes humanos já caracterizados, e seu transcrito mais longo é formado a partir de 67 partes (exons).

Outra peculiaridade do gene é sua formidável capacidade de gerar diferentes transcritos, por meio de um processo que os biólogos moleculares chamam de splicing alternativo. Estudos posteriores ao trabalho de Phillip Sharp (Prêmio Nobel de 1993), que descobriu os mecanismos básicos de splicing, mudaram a forma de ver os genes. Até então, a ciência postulava que cada gene continha instruções para que as células produzissem uma única forma de proteína. Um gene, de acordo com esse preceito, podia processar e usar de apenas uma maneira a sua seqüência de bases, incluindo adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T). Conseqüentente, o resultado desse processamento sempre tinha de ser igual, uma estável receita química (chamada tecnicamente de gene transcrito ou simplesmente transcrito) que fornecia sempre as mesmas informações para as células, que, obviamente, acabavam fabricando sempre a mesma proteína.

Gene peculiar
No entanto, hoje se sabe que muitos genes humanos são capazes de utilizar seus exons em diferentes combinações. Em outras palavras, alguns genes podem gerar diferentes produtos de splicing, o que pode levar à formação de mais de um tipo de proteína, se forem traduzidos. Esse é o caso – e particularmente intenso – do gene relacionado à enfermidade. “Já identificamos mais de 20 transcritos do gene PKHD1, mas o total pode ser bem maior”, comenta Onuchic. “Essa multiplicidade de variantes de splicing é uma característica incomum em genes de mamíferos.”

Na literatura científica, há registro de achados semelhantes para a família de genes das neurexinas. Em número de três, esses genes podem dar origem, por meio de splicing alternativo, a mais de 1.000 formas diferentes de proteínas. A análise da estrutura da poliductina sugere que a proteína codificada pelo gene PKHD1 possa funcionar como um receptor (celular), mas deixa aberta a possibilidade de atuar como uma molécula ligante (que se une a outra proteína) ou como uma enzima associada à membrana.

No caso de PKHD1, os cientistas ainda não podem precisar quantas variantes da poliductina são produzidas pelos muitos transcritos codificados pelo gene. Sabem, contudo, que vários transcritos, se forem traduzidos, levarão à síntese de duas formas de proteína: poliductina-M e poliductina-S. Cada forma, por sua vez, constitui um grupo com subvariantes da proteína. Enquanto o grupo das poliductinas-M inclui as formas da proteína provavelmente associadas à membrana plasmática, o das poliductinas-S inclui as proteínas que podem ser secretadas.

Entre todas essas subvariantes da proteína, a maior – e provavelmente a mais importante – é uma poliductina-M formada por 4.074 aminoácidos (as unidades químicas das proteínas). Por que ela é vista com mais atenção do que as outras? Porque essa forma da poliductina é produzida pelo único transcrito que seria alterado por todas as mutações descritas até o momento. Em outros termos, os resultados da pesquisa sugerem que essa proteína se mostre truncada ou defeituosa em todos os doentes nos quais já foram detectadas mutações em ambas as cópias do gene.

“No entanto, ainda não sabemos se a doença decorre apenas da redução, abaixo de níveis críticos, da quantidade da proteína mais longa normal, ou se a perda de um balanceamento funcional entre as diferentes formas da proteína, decorrente de mutações, também participa da gênese do problema”, comenta Onuchic. Segundo o pesquisador, a estrutura das maiores proteínas produzidas pelas neurexinas é similar à da poliductina-M.

Um dos desafios imediatos dos pesquisadores é estabelecer possíveis correlações entre os vários tipos de mutação encontrados no gene e a natureza e a severidade das manifestações clínicas da ARPKD. Outro desafio, cuja elucidação deverá ser progressiva e demorada, é entender o papel dessa nova proteína em indivíduos sadios e como sua alteração leva à ARPKD. “Esperamos ser capazes um dia de manipular as vias de sinalização relacionadas a essa proteína, de forma a contornar essa desordem genética”, almeja Gregory Germino, da Universidade Johns Hopkins, ao expressar o desejo comum da equipe.

O Projeto
Genética Molecular da Doença de Rim Policístico Autossômica Recessiva Humana (nº 00/00280-3); Modalidade Linha regular de auxílio à pesquisa; Coordenador Luiz Fernando Onuchic – Faculdade de Medicina da USP; Investimento R$ 272.389,66

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