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Entre les sucres et les gènes

Une application de la connaissance scientifique sur la canne à sucre pourra permettre le développement de nouveaux outils pour 
la production d’éthanol

Publié en Octobre 2012

Pousses de canne à sucre transgénique à I´Institut de Chimie de I´USP

LÉO RAMOS Pousses de canne à sucre transgénique à I´Institut de Chimie de I´USPLÉO RAMOS

Les plus vieux diraient que la canne à sucre est en train de vivre un bouleversement total compte-tenu du volume d’études génétiques, physiologiques et agronomiques dont elle a fait l’objet depuis ces dernières années. Ces études visent à connaître plus profondément la plante et ses particularités afin d’augmenter la productivité de cette graminée apportée au Brésil par les portugais au XVIe siècle. L’objectif final est de produire davantage d’éthanol à l’hectare. Ainsi, les recherches menées visent à adapter davantage la canne à sucre à la deuxième génération de production d’éthanol, quand les enzymes vont profiter des sucres récupérés de la bagasse de canne à sucre pour la formation d’une espèce de soupe et produire ensuite plus de biocarburants. Ainsi, des chercheurs appartenant à différentes institutions brésiliennes ont un œil sur la recherche de base et l’autre sur l’avenir du processus industriel de production d’éthanol. L’avancée de la connaissance scientifique dans ce domaine a commencé en 1999 avec le lancement du projet Génome Canne, financé par la FAPESP. Les derniers résultats obtenus confirment que le chaume et les feuilles de la canne à sucre possèdent plus de sucres (substances essentielles pour la production d’éthanol), dans la portion hémicellulose que dans la cellulose, une découverte qui peut changer les orientations de la production d’éthanol de deuxième génération dans l’avenir.

«Nous avons réalisé des études sur la paroi cellulaire du chaume et les feuilles de canne à sucre qui indiquent la présence d’environ 30 % de sucres dans la cellulose, 50 % dans l’hémicellulose, outre 10% de pectines. La technologie qui est en train de se dessiner pour la deuxième génération d’éthanol repose uniquement sur la cellulose, alors que les polymères de sucre des hémicelluloses, qui contiennent des sucres complexes comme les arabinoxylanes, les bêta-glucanes et les xyloglucanes, sont laissés de côté, outre les pectines, qui ensemble représentent 70 % des sucres de la paroi cellulaire de la canne à sucre», déclare Marcos Buckeridge, professeur à l’Institut de Biosciences de l’Université de São Paulo et coordonnateur de l’Institut National des Sciences et de la Technologie (INCT) du Bioéthanol, qui rassemble 31 laboratoires dans cinq états brésiliens. Sur les parois cellulaires de la canne à sucre, les hémicelluloses et les pectines, localisées entre les microfibrilles qui sont des agglomérés de molécules de cellulose, possèdent de nombreux sucres composés de cinq atomes de carbone et pour cela ne sont pas viables pour les levures (Saccharomyces cerevisiae) utilisées dans la fermentation du jus de la canne à sucre. Ces levures sont habituées avec le saccharose, formé de glucose et de fructose et trouvé dans le jus de canne ou même dans le glucose de la cellulose et de certaines hémicelluloses, et qui possède six atomes de carbones.

La future exploitation des pentoses de la bagasse par hydrolyse, qui sont des sucres à cinq atomes de carbones, pourrait déboucher sur une augmentation de la production brésilienne d’éthanol de plus de 5 milliards de litres, pour une production actuelle d’environ 25 milliards de litres. Les pentoses pourront également être utilisés dans des applications biotechnologiques, dans des aliments et des médicaments, apportant ainsi une valeur ajoutée à la bagasse. Dans les processus de deuxième génération, les enzymes forment un liquide qui sert également à alimenter les propres levures. «Il y a des tentatives visant à produire des lignées de Saccharomyces, y compris au Laboratoire National des Sciences et de la Technologie du Bioéthanol (CTBE), ainsi que dans d’autres institutions et entreprises brésiliennes et étrangères, qui sont capables d’utiliser les sucres à cinq atomes de carbone. Les anglais et les suédois ont déjà démontré que cela était possible, mais tout est réalisé en laboratoire et dans un environnement stérilisé. Ce n’est donc pas encore suffisant pour les usines brésiliennes. Il faut que les levures soient robustes pour survivre à la présence d’autres microorganismes, comme les bactéries, qui existent dans un environnement non stérilisé», déclare Marcos Buckeridge, qui est également directeur scientifique du CTBE, à Campinas, état de São Paulo.

Il y a encore de nombreux doutes, même en ce qui concerne les expérimentations liées à l’étape la plus importante qui est l’hydrolyse de la cellulose. «Il y a déjà une bonne connaissance du processus de prétraitement, mais nous devons encore mener des recherches sur les différentes options nous permettant de réaliser l’hydrolyse de manière à ce que l’industrie puisse l’absorber rapidement et de manière économique et durable», dit le professeur Rubens Maciel Filho, de l’Université Publique de Campinas (Unicamp), l’un des coordonnateurs du Programme FAPESP de Recherche en Bioénergie (Bioen) duquel participe également l’INCT Bioéthanol. «Des évaluations technoéconomiques et de durabilité sont nécessaires. Dans ce cas il s’agit d’analyses sur la consommation d’eau et sur l’utilisation de produits chimiques dans le processus d’hydrolyse», déclare Maciel Filho.

«Aujourd’hui, dans les expérimentations de deuxième génération, la bagasse qui a été séparée, après la première génération quand on extrait le jus de la canne pour faire l’éthanol, passe par un processus de rupture des parois cellulaires pour obtenir la cellulose qui est entourée d’hémicellulose et de lignine, un polymère qui ne possède pas de sucre», dit Marcos Buckeridge. La rupture est actuellement réalisée à l’aide de vapeur à haute pression. Ainsi, la paroi cellulaire de la bagasse se desserre et les composants sont séparés à l’aide de solvants, d’acides et d’enzymes. «C’est l’usage de la force. Un effort est produit pour se débarrasser de tout ce qui entoure la cellulose», déclare le professeur de l’USP. «Notre intention est de commencer le processus d’hydrolyse sur le terrain et de produire de la canne à sucre mieux préparée pour la deuxième génération, pour faciliter l’hydrolyse et pour qu’il ne soit plus nécessaires de laver la bagasse, car cela retire beaucoup de sucre du matériel».

Dans un article qui sera publié dans la revue BioEnergy Research, Rubens Maciel Filho, accompagné par deux autres chercheurs de son groupe à l’USP et par deux autres chercheurs du Centre de Carbohydrates Complexes de l’Université de Géorgie, aux États-Unis, décrivent la recherche qui identifie les fractions de chaque polymère de sucre dans la canne à sucre et font des observations sur la complexité de la paroi cellulaire et sur la difficulté de trouver les clés chimiques ou un code qui permettraient de mieux profiter de la chaîne des polysaccharides. Ils pensent également que le résultat de la composition des sucres dans la canne à sucre pourrait amener un changement dans le processus de deuxième génération. En se basant sur les données actuelles, Marcos Buckeridge imagine que la meilleure solution possible pour l’avenir serait d’utiliser la canne entière dans le processus d’hydrolyse après que le jus soit extrait dans la première génération.

ALEXANDRE AFFONSO«La biologie des parois cellulaires est au cœur de ces avancées et elle est essentielle pour réaliser des progrès technologiques dans le domaine des biocarburants durables et les biomatériaux», commente le professeur Leonardo Gomez, du Département de Biologie de l’Université de York, en Angleterre. Leonardo Gomez, qui est argentin, est venu au Brésil en 2010 pour connaître le CTBE. «Selon de nombreux spécialistes, le développement des biocarburants de deuxième génération est favorisé par une industrie de première génération déjà bien implantée. Le Brésil possède ainsi un environnement propice pour que cela puisse se développer. Mais il s’agit seulement d’un potentiel, quelqu’un doit assumer le risque et investir dans le domaine sur un plan industriel», déclare Leonardo Gomez.

Dans la pratique et pour parvenir à une avancée du processus visant à produire de l’éthanol de deuxième génération, Marcos Buckeridge met en avant un prétraitement physiologique qui laisse la plante plus malléable et qui facilite le traitement durant l’hydrolyse. «Il s’agit d’une substance qui, quand elle est appliquée sur de jeunes plants, inhibe une enzyme de la canne à sucre qui va produire des phénylpropanoïdes, qui sont les précurseurs de la lignine, la substance qui lie les sucres dans la paroi cellulaire et qui favorise la résistance mécanique de la plante. Nous ne savons pas encore vraiment ce qui se produit, mais il a été possible, grâce à ce composé d’augmenter de 30 % le traitement des xylanes, qui représentent 50 % de la composition des hémicelluloses», dit Marcos Buckeridge. L’utilisation de cette substance, composée d’acide pipéronylique de la canne, a été brevetée et déposée par Marcos Buckeridge auprès de l’Institut National de la Propriété Industrielle (INPI) et par son ancien post-doctorant Wanderley dos Santos, professeur à l’Université Fédérale du Paraná (UFPR), qui teste actuellement le produit sur le terrain. «Nous devons encore l’améliorer et essayer d’en réduire le coût», dit Marcos Buckeridge.

Une autre solution pour la deuxième génération est en train d’être élaborée dans le cadre du Bioen, où 13 groupes de chercheurs participent à la création d’une super-canne, avec plusieurs variétés agronomiques et génétiques de haute qualité destinées à la première et la deuxième génération. L’une de ces plantes possède une plus grande capacité de photosynthèse. Les chercheurs ont déjà identifié au moins quatre gènes responsables de la capture de la lumière solaire. Ces gènes pourront être liés à l’augmentation du taux de croissance du nombre de cellules et par conséquent à une hausse de la production de saccharose. La création de plantes transgéniques fait partie des outils biotechnologiques pour la création de cette super-canne. Dans ce cas, le procédé transgénique ne se limiterait pas seulement à l’insertion de gènes externes mais à l’activation ou à la désactivation de gènes de la canne à sucre. «Nous pourrions également créer des plantes avec des parois cellulaires plus adaptées à la deuxième génération», déclare Marcos Buckeridge. «Penser de la sorte peut sembler futuriste, mais le Bioen possède des gènes relatifs à la paroi cellulaire transformée, avec lesquels nous pensons faire de la «canne-papaye», par exemple». Cette canne futuriste aurait quelques caractéristiques identiques à la papaye, qui est plus sucrée et plus tendre une fois cueillie et avoir mûri.

«Nous avons déjà 380 gènes liés au saccharose et plus de mille relatifs à la résistance à la sècheresse», déclare la professeur Glaucia Mendes Souza, de l’Institut de Chimie (IQ) de l’USP, qui avec la professeur Marie Anne van Sluys, de l’Institut de Biosciences de l’USP, dirige la recherche génomique de la canne à sucre dans le cadre du Bioen et qui compte sur la participation du professeur Marcelo Menossi, de l’Institut de Biologie de l’Université Publique de Campinas (Unicamp). 250 de ces gènes sont en train d’être testés sur des pousses de canne à sucre disposées dans des tubes, des cuves et des pots à l’IQ de l’USP ou dans des serres à l’École d’Agriculture Luiz de Queiroz, de l’USP, à Piracicaba, dans des expérimentations coordonnées par la professeur Helaine Carrer, qui analyse l’expression des gènes. L’expression des gènes de la canne à sucre sur du tabac est également testée, il s’agit d’une plante plus facile à manipuler en laboratoire et qui sert de modèle pour ce type d’expérimentation. Deux gènes de la canne à sucre liés à la résistance à la sècheresse ont déjà été exprimés dans le tabac et ont fait l’objet d’un brevet déposé à l’INPI.

Pour transformer la plante avec des gènes d’intérêt il faut des promoteurs nécessaires, des outils biotechnologiques comme des séquences d’ADN où le gène va s’exprimer. C’est dans ces molécules que les chercheurs vont moduler la super-expression ou la désactivation des gènes. 
«Cette année, nous avons déposé un brevet concernant 10 promoteurs de canne à sucre qui vont permettre l’expression des gènes de manière différente», déclare Glaucia Mendes Souza. En ce qui concerne les parois cellulaires de la canne à sucre, Glaucia Mendes Souza déclare qu’elle a déjà développé des plantes avec des gènes désactivés liés à la production de lignine. «La lignine gêne l’exécution de la deuxième génération car elle complique l’extraction des polysaccharides, mais quand nous désactivons sa production, dans certaines expérimentations, la verse se produit, situation dans laquelle la plante se couche sur le sol. Nous devons trouver des variétés qui nous permettent de trouver un juste milieu, en diminuant la présence de lignine mais en maintenant la plante debout», explique Glaucia Mendes Souza.

Al’autre extrémité de la recherche académique liée à l’hydrolyse se trouvent les études visant à obtenir des enzymes chaque fois plus efficaces pour rompre les parois cellulaires de la canne à sucre, extraire les sucres et préparer le matériel pour la production d’éthanol. Mais quelles enzymes utiliser pour le traitement des différents polysaccharides présents dans la paroi cellulaire de la plante ? Certaines enzymes utilisées par l’industrie alimentaire, par exemple, sont en train d’être testées avec la canne à sucre mais elles ne résolvent pas tout. «Ces enzymes industrielles sont principalement produites par des champignons», explique le professeur Richard Ward, du Département de Chimie de la Faculté de Philosophie, Sciences et Lettres de Ribeirão Preto, à l’USP, et du CTBE, qui a déjà réussi à créer deux enzymes multifonctionnelles agissant sur les hémicelluloses. Il s’agit d’enzymes chimériques produites par des bactéries.

«Nous savons que la cellulose est le composant le plus caché par rapport aux autres polysaccharides présents dans la paroi cellulaire de la canne à sucre et l’enjeu est de créer des enzymes qui détruisent et dégradent, de manière programmée, les autres composants, qui sont également une source importante de sucres, jusqu’à arriver à la cellulose», explique Richard Ward. «Il est important de développer les enzymes les plus appropriées pour chaque polysaccharide. Cependant il est encore difficile de trouver de bonnes enzymes à faible coût. Elles sont aujourd’hui commercialisées à des dizaines de dollars le kilo. Cela peut sembler bon marché mais nous devons penser au traitement de centaines ou même de milliers de tonnes de matériel lignocellulosique par jour dans les usines». Richard Ward explique que l’objectif est de créer des enzymes chimériques, où chacune attaquerait plus d’un polymère de la bagasse de la canne à sucre. «Ceci est important principalement pour les hémicelluloses qui possèdent un ensemble hétérogène de polysaccharides».

De nouvelles recherches menées sur les enzymes sont apparues, inhabituelles mais se basant sur la plus pure observation de la nature. À la recherche d’enzymes qui détruisent la cellulose et le matériel lignocellulosique, comme la bagasse, le professeur Ednildo Machado, de l’Institut de Biophysique, de l’Université Fédérale de Rio de Janeiro (UFRJ), étudie la composition enzymatique de l’appareil digestif de deux blattes, Periplaneta americana, commun dans les grandes villes, et Nauphoeta cinerea, créées pour alimenter des animaux en captivité comme des lézards et d’autres reptiles. «Lors d’expérimentation en laboratoire, j’ai alimenté des blattes avec seulement de la bagasse de canne à sucre et elles ont réussi à digérer les parois cellulaires de ce matériel pour survivre de manière très positive», déclare Ednildo Machado. C’est ainsi qu’il a commencé à penser aux possibles enzymes de l’appareil digestif de ces insectes qui pourraient être utiles dans la deuxième génération de production d’éthanol.

Ednildo Machado a été présenté à Marcos Buckeridge au cours du Congrès Brésilien de Biochimie en 2010 et, à partir de là, ont noué une étroite relation. Il était présent au CTBE, et diverses expérimentations ont été réalisées. «Nous avons réussi à identifier certaines enzymes qui sont produites par des bactéries à l’intérieur de l’appareil digestif des blattes. Nous ne savons pas encore si ces bactéries étaient déjà là ou si l’insecte les a acquises du matériel, dans ce cas la bagasse». La blatte peut également produire les enzymes par le biais de champignons et de protozoaires et a une grande facilité pour s’alimenter d’un large éventail de déchets, outre le fait de s’adapter facilement à cette diversité. «Cette caractéristique nous a permis d’identifier chez ces insectes une série d’enzymes qui sont excellentes dans différents processus technologiques», déclare Ednildo Machado. Le prochain pas sera justement d’identifier quels sont les microorganismes qui produisent les enzymes. Pour cela il faut séquencer tous les ADN présents dans l’intestin de la blatte, dans un processus appelé métagénomique, qui permet d’identifier les espèces et les gènes impliqués dans la production d’enzymes spécialisées pour rompre la cellulose et l’hémicellulose de la bagasse de canne à sucre. Une fois les gènes identifiés, il est possible de les cloner dans des bactéries comme Escherichia coli et ainsi viabiliser la production de ces enzymes à une échelle industrielle. Le même procédé commence à être utilisé par le professeur Richard Ward pour produire en laboratoire les enzymes qui attaqueront la paroi cellulaire de la canne à sucre.

Le développement de ces nombreux outils pourront aider la canne à sucre à produire davantage d’éthanol dans les prochaines années. «Ces 10 dernières années, nous avons vu une augmentation exponentielle de la recherche et de l’investissement technologique afin d’utiliser la biomasse comme un substitut renouvelable et durable du pétrole», déclare Leonardo Gomez, de l’université de York. «La recherche actuelle menée dans le domaine de la composition de la biomasse présente déjà un nouveau potentiel pour l’énergie biorenouvelable». D’après lui, la production d’éthanol et de produits chimiques avec des performances élevées à partir de la biomasse n’est possible qu’avec une connaissance détaillée et multidisciplinaire de la biologie et de la biochimie de la biomasse.

Projets
1. Institut National de Sciences et de Technologie (INCT) du Bioéthanol – nº 2008/57908-6; Modalités Projet Thématique du Programme FAPESP de Recherche en Bioénergie (Bioen); Coordonnateurs Marcos Silveira Buckeridge – USP; Investissement 2.896.588,59 reais et 303.342,92 de dollars US (FAPESP);
2. Sugarcane signaling and regulatory networks – nº 2008/52146-0; Modalités Projet Thématique du Programme FAPESP de Recherche en Bioénergie (Bioen); Coordonnateurs Glaucia Mendes Souza – USP; Investissement 3.390.743,73 reais et 1.174.768,67 de dollars US (FAPESP);
3. Identification, caractérisation et ingénierie d’enzymes qui dégradent la paroi cellulaire des plantes – nº 2010/18850; Modalités Projet Thématique; Coordonnateurs Richard John Ward – USP; Investissement 491.952,05 reais et 313.495,03 de dollars US (FAPESP).

Articles Scientifiques
De Souza, A.P. et al. Composition and structure of sugarcane cell walls: implications for cell wall hydrolysis and second generation bioethanol. BioEnergy Research. In press. set. 2012.
Begcy, K. et al. A novel stress-induced sugarcane gene conferstolerance to drought, salt and oxidative stress in transgenic tobacco plants.
Plos One. v. 7, n. 9, e44697. set. 2012.
Furtado, G.P. et al. A designed bifunctional laccase /b-1,31,4 – glucanase enzyme shows synergistic sugar release from milled sugarcane bagasse. Protein Engineering, Design & Selection. In press. set. 2012.

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