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ENGENHARIA GENÉTICA

Milhos produtores de hormônio

Substância de origem vegetal abre perspectivas ao tratamento do nanismo

Todas as células de um determinado organismo contêm os mesmos genes. Mesmo assim, não há confusão entre as funções que as células desempenham. O fígado não vai deixar de produzir enzimas para fazer cabelo nem a pele vai liberar adrenalina. A harmonia se deve aos chamados promotores, regiões regulatórias dos genes que determinam em que momento, quantidade e local as substâncias devem ser produzidas. A partir do controle desses maestros do organismo, o pesquisador Adilson Leite, da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), desenvolveu com sua equipe um processo de produção de proteínas em plantas e fez com que sementes de milho produzissem o hormônio de crescimento humano.

Os resultados obtidos no final de setembro ainda são preliminares, mas promissores. As sementes de milho modificadas geneticamente elaboraram um hormônio de crescimento ou hGH (do inglês human Growth Hormone) que até o momento tem se mostrado idêntico ao produzido pelo organismo humano. Pode estar se abrindo um caminho para a fabricação, em larga escala e a custos reduzidos, de um composto químico de grande interesse médico. Indispensável no tratamento de crianças com problemas de crescimento, o hGH é atualmente obtido por meio de bactérias. Segundo Leite, com o rendimento já obtido, bastaria uma área equivalente a um campo de futebol para produzir uma tonelada de milho, o suficiente para o tratamento de aproximadamente mil crianças por ano.

Paranaense, graduado em Farmácia, Leite resolveu há três anos aplicar os conhecimentos das pesquisas básicas sobre a regulação de genes em sementes, que estudava desde 1988, quando ingressou no Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) da Unicamp. O trabalho com o hormônio de crescimento faz parte do projeto temático Sementes: Regulação Gênica da Síntese de Proteínas de Reserva e Metabolismo de Lisina ; e Estudos da Expressão de Proteínas , sob sua coordenação, com um financiamento de R$ 98 mil da FAPESP.

Enfoque diferenciado
Há anos os centros de pesquisa do mundo inteiro procuram induzir os vegetais a produzir substâncias que lhes são estranhas, utilizando toda a planta, as folhas ou a raiz. Na trilha de poucos especialistas dos Estados Unidos e do Canadá, Leite elaborou um mecanismo de expressão genética específico em semente, o órgão da planta mais apropriado para armazenar proteínas. As sementes – sobretudo a de cereais, como o milho, o sorgo e o arroz – têm um tecido especializado, o endosperma, um reservatório natural de proteínas, utilizadas quando o embrião germina.

Leite iniciou seu projeto separando as duas regiões básicas de todo gene: a estrutural, que indica o que o gene deve produzir (glicose, enzimas ou hormônios, por exemplo), e a regulatória, que controla em que partes do organismo, quando e com que intensidade ele deve atuar. Seu plano: tomar o promotor que controla a produção de proteínas de reserva em sementes de sorgo (Sorghum sp.), uma planta próxima do milho (Zea mays), e a ela anexar a região estrutural do gene que controla a síntese de hGH. Assim, o gene estaria preparado para produzir hGH, como se fosse uma proteína a ser armazenada nas sementes, de acordo com as ordens transmitidas pelo trecho regulador.

Os músicos seriam trocados, mas o maestro não perceberia. Detalhe: Leite assegura que mesmo produzindo menos proteína ou amido a semente germinará do mesmo modo, porque as variedades atuais resultam de melhoramento genético e há bastante material de reserva para o embrião. No início, Leite trabalhou em colaboração com Hamza El-Dorry, do Instituto de Química da Universidade de São Paulo (USP), que isolou o gene do crescimento humano, usado em estudos de produção de hGH em bactérias. Com uma cópia desse gene, moldou uma estrutura, o chamado cassete para a expressão de proteínas heterólogas (não produzidas pelo organismo em condições normais) em plantas transgênicas.

O plasmídeo (DNA circular) que os pesquisadores fizeram, para funcionar direito, precisa de dois genes: um que levará à produção de hGH e outro que promove a resistência a um herbicida, cuja função é selecionar as plantas modificadas, aptas a produzir hGH. Esse material genético tem origens variadas. Há material genético proveniente do de Coix (Coix lacryma-jobi, também conhecida como lágrimas-de-nossa-senhora), uma gramínea aparentada do milho, e do vírus do mosaico-da-couve-flor.

O plasmídeo integrou-se ao genoma de uma agrobactéria, a Agrobacterium tumefaciens, hábil em infectar plantas (são elas que causam os tumores ou protuberâncias facilmente perceptíveis em caules de árvores). Definido como um vetor de transformação, o plasmídeo encaixa o gene estranho em regiões ativas do cromossomo do milho. Leite fez com que as bactérias infectassem inicialmente folhas de tabaco (Nicotiana tabacum ), que permitem a transferência de genes sem grandes dificuldades. Após seleção com um antibiótico, 67 plantas cresceram normalmente e produziram hGH. Mas nem tudo estava resolvido. “Para produzir proteína, a semente de tabaco é amadora, com um espaço restrito de armazenamento de proteínas”, diz ele.

A passagem para o milho exigiu alguns ajustes. Um deles, a substituição do antibiótico por um herbicida, ficou a cargo de Paulo Cézar De Lucca, que faz doutorado, e de Edson Luís Kemper, em pós-doutoramento, e Márcio José da Silva, pesquisador do CBMEG. As sementes de milho, estas sim, são profissionais, bem maiores – um galpão de uma fábrica, enquanto a outra seria equivalente a um carrinho de supermercado. Com o tabaco, diz Leite, o rendimento era de 0,2%. Em milho, os resultados preliminares indicam uma produção próxima a 0,5% de proteína solúvel, de modo que de uma tonelada possam ser extraídas 250 gramas de hGH.

Germinaram 4.000 sementes de milho, cujas linhagens incorporaram o gene de hGH. Das 300 já analisadas, quatro incorporaram o gene estrangeiro ao genoma e uma, pelo menos, produz a proteína desejada na semente. “Foi uma surpresa que tenha funcionado”, reconhece Leite. Tabaco e milho, lembra ele, são plantas bem distintas. A primeira, uma dicotiledônea, tal qual o feijão e soja, é mais conhecida e, principalmente, sensível às agrobactérias disponíveis quando o trabalho começou.

O milho, uma monocotiledônea, como o arroz, era indiferente às agrobactérias de três anos atrás. Só pôde ser atingido por um novo plasmídeo, chamado superbinário, que fez as bactérias mais virulentas. Mas o gene continuará se expressando? Leite não arrisca um palpite, mas conta que no tabaco a técnica permitiu que o gene se mantivesse ativo durante sete gerações seguidas – um resultado considerado ótimo, que indica que o material foi incorporado pelo genoma da planta.

Moléculas idênticas
Leite ainda não estimou os custos da purificação do hormônio de crescimento, mas se certificou de que pode ter aberto um caminho inovador. O hGH é produzido atualmente em bactérias em condições muito melhores do que no início do século, quando era retirado da hipófise de cadáveres, sob risco de contaminação. “Em plantas, esse risco é muito menor”, assegura. Além disso, o hGH extraído de sementes está pronto para ser usado. Segundo o pesquisador, o hGH produzido em bactéria tem um aminoácido a mais, a metionina, que pode ser vista como antígeno pelo organismo e originar uma reação alérgica. No sintetizado em plantas, diz ele, o primeiro aminoácido é a fenil-alanina, tal qual ao produzido normalmente em humanos.

Leite conta que é importante verificar com o máximo rigor se o hormônio produzido pela planta é idêntico ao elaborado pelo organismo humano. Segundo ele, todas as análises realizadas até o momento indicam que são indistinguíveis. Quanto maior a semelhança, menor a necessidade de testes a serem feitos e mais concreta a possibilidade de licenciamento da tecnologia para início de comercialização.

“A ação depende da estrutura”, diz ele. Por garantia, estão previstos experimentos em animais sem hipófise, que vão se somar aos já realizados com o hormônio proveniente de semente de tabaco, que, como se verificou, reconhece os receptores das células-alvo de fígado de coelho, usadas nas experiências, tal qual o hormônio produzido pelo próprio organismo.

O plasmídeo

Estes são os elementos básicos do plasmídeo com o gene do hormônio de crescimento humano que a agrobactéria poderá implantar no genoma do milho.

Onde, quando e quanto fazer?
PGK ou promotor de gama-kafirina é a região regulatória do gene que codifica a proteína de reserva gama-kafirina no sorgo. Informa a molécula de RNA polimerase, no núcleo da célula do milho, sobre quanto, quando e onde do trecho seguinte do gene deve ser copiado na forma de RNA mensageiro e enviado para o citoplasma, onde servirá de molde para a produção do hGH.

Para onde levar?
PS ou peptídeo-sinal, retirado da região estrutural de um gene de Coix, direciona a produção de hGH para o retículo endoplasmático, um dos compartimentos da célula, onde o hGH é enovelado corretamente. Uma enzima retira o PS enquanto a molécula de hGH entra no retículo, na etapa final do processo. Depois desse corte, a proteína processada está pronta para ser liberada pela célula.

O que fazer
hGH representa a região do gene retirado da hipófise que contém as informações necessárias para a produção do hGH.

Quando parar?
O 3´35S é um sinal de terminação do processo de transcrição (cópia) do gene para RNA mensageiro. É um trecho de RNA do vírus que causa o mosaico-da-couve-flor.

Onde, quando e quanto fazer?
O P35S é um promotor, que controla a expressão do gene seguinte, o bar. Também se origina do vírus que causa o mosaico-da-couve-flor.

O que fazer?
O gene bar promove a resistência a um herbicida, que vai ajudar na seleção das plantas transformadas geneticamente. Contém as informações para a produção da enzima fosfinotricina acetil-transferase, que confere resistência ao herbicida fosfinotricina.

Quando parar?
O 3´NOS é um trecho de um gene da própria agrobactéria que atua como sinal de terminação e assinala o ponto final do processo de produção do RNA mensageiro a partir do gene bar.

Como selecionar?
Spc é um gene que promove a resistência ao antibiótico espectinomicina. Funciona como uma marca para selecionar e reconhecer as agrobactérias: as que receberem o plasmídeo serão resistentes ao antibiótico e poderão ser implantadas no genoma do milho.

As mudanças na semente do milho

A nova frente da biotecnologia

Pesquisas como a realizada pela equipe de Adilson Leite, na Unicamp, reforçam a posição do Brasil em uma nova área de pesquisa biotecnológica que avança rapidamente no exterior. É a chamada Molecular Farming ou Agropecuária Molecular, que consiste no uso de plantas e de animais como biorreatores ou minifábricas de proteínas de interesse farmacêutico ou industrial, como enzimas, anticorpos e vacinas, a baixo custo e em grande quantidade.

Já há empresas nos Estados Unidos que produzem anticorpos monoclonais em plantas, em lotes milhares de vezes maiores que os hibridomas (cultura de células de camundongos), a ponto de permitir seu uso intensivo, até mesmo em pomadas. Mesmo os desvios das pesquisas estão se mostrando úteis. Pesquisadores norte-americanos anunciaram há quatro anos que foram capazes de produzir um anticorpo do tipo IgA, a partir de tabaco. Esse anticorpo reconhece a adesina, uma proteína da parede da bactéria responsável pela fixação da bactéria na dentina. Foi o bastante para ganhar uma aplicação mais trivial, como aditivo em dentifrício.

Perfil :
Adilson Leite, 42 anos, graduou-se em Farmácia na Universidade Estadual de Ponta Grossa, no Paraná, e obteve o doutoramento em Bioquímica pela Universidade de São Paulo. Trabalhou na Fundação de Tecnologia Industrial (FTI), de Lorena, e na Agroceres. Ingressou em 1988 no Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

Projeto :Sementes: (1) Regulação Gênica da Síntese de Proteínas de Reserva e Metabolismo de Lisina; (2) Estudos da Expressão de Proteínas
Investimento : R$ 98.010,00

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