En una pequeña sala del laboratorio del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (USP), donde caben unos pocos aparatos y una microcomputadora, se manipula un instrumento de alto poder de resolución que es único en Brasil: el microscopio de fuerza atómica aplicado al área biológica modelo Bioprobe. Una técnica creada por el investigador Ricardo de Sousa Pereira permite que dicho instrumento, instalado en el laboratorio del Departamento de Parasitología, mapee la superficie de células vivas e identifique con precisión los puntos en los cuales ocurren, por ejemplo, fenómenos tales como la entrada y salida de iones de calcio. En ese caso, dice Pereira, “tal técnica se basa en la inmobilización de medicamentos bloqueadores de calcio en la punta de la sonda del aparato”, lo que permitirá el desarrollo de bloqueadores de calcio más eficientes para bajar la presión arterial.
El proyecto Utilización de Biosensores Hechos con la Sonda del Microscopio de Fuerza Atómica Aplicado al Área Biológica para Mapear Canales de Iones en la Superficie de Células, dirigido por Pereira y financiado por la FAPESP, comenzó en diciembre de 1998 y será concluido en diciembre de 2001. El investigador remarca que la gran ventaja de ese aparato reside en la posibilidad de visualizar material vivo: “Un microscopio electrónico de barredura tiene un poder de visualización comparable al de fuerza atómica, pero el fijador utilizado en la preparación de la muestra mata a las células”.
Según Pereira, las informaciones obtenidas por el Bioprobe permitirán desarrollar medicamentos más eficaces, ya que éstos tendrán una actuación bien localizada: los bloqueadores de calcio solo actuarán en los canales de calcio de las células, a través de los cuales el mineral atraviesa la membrana celular, lo que redunda en un alto grado de eficiencia en el bloqueo a la entrada excesiva del mineral en las células. Otra ventaja es la ausencia prácticamente de efectos colaterales, ya que los medicamentos no interferirían en ningún otro proceso químico del organismo, ni siquiera en las reacciones acaecidas en otros puntos de la célula.
Descubrimiento casual
El investigador cuenta que él y su colaborador Nivaldo Antônio Parizzotto, de la Universidad Federal de São Carlos, descubrieron casualmente la capacidad que el equipo tiene para visualizar material biológico vivo: células, tejidos, organelas, etc. “En 1991, yo estaba trabajando en el microscopio de fuerza atómica del Laboratorio de Fotónica de la Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad Estadual de Campinas (Unicamp), dirigido por el profesor Vítor Baranauskas. Ese fue el primer equipo de ese género en América Latina. Un día, nos olvidamos en él una muestra de levadura biológica de panadería, preparada en una lámina con medio de cultivo. Al día siguiente, al intentar retirar la lámina, notamos que la sonda del microscopio – llamada cantilever – estaba adherida a la muestra, porque ésta había crecido en área y altura durante la noche. En ese momento, pensamos que las células podrían estar vivas. Ellas se multiplicaron y el crecimiento en altura alcanzó la sonda del equipo.”
Las posibilidades de ese descubrimiento son amplias. En julio último, por ejemplo, el investigador publicó un artículo en la revista Febs Letters, de la Federación de Sociedades Bioquímicas Europeas, en el que demuestra cómo un biosensor hecho con la sonda del microscopio puede detectar la absorción de moléculas de glicosa por parte de células vivas de Saccharomyces cerevisae, la levadura conocida también como fermento biológico de panadería. Según Pereira, “esa metodología será interesante para los científicos que estudian la diabetes”.
Pereira revela que la publicación del artículo hizo que el director de la Escuela de Medicina de la Universidad Yale, en Estados Unidos, lo invitara a escribir una revisión, que será publicada en la revista Biochemical Pharmacology: “En ella, se incuerporaron otros interesantes resultados con biosensores: vale la pena destacar la detección de alcohol etílico con un cantilever cubierto con la enzima alcohol desidrogenasa tipo II – que transforma alcohol etílico en glutaraldeido – y la detección de especies reactivas de oxígeno usando la enzima superóxido dismutasa, que detecta iones superóxidos, y la catalasa, que detecta peróxido de hidrógeno, es decir, agua oxigenada”. El investigador dice también que científicos de IBM hicieron de la sonda del aparato una especie de chip de ADN (ácido desoxirribonucleico), para identificar mutaciones en genes: las llamadas SNPs (polimorfismos simples de nucleótidos).
Contra virus
Otra posible aplicación comentada en la revisión de Pereira es la inmobilización de una partícula de virus en la punta de la sonda del equipamiento – el cantilever – para medir la fuerza de adherencia necesaria para que el virus infecte la célula: con ese dato, los científicos podrán pensar en medicamentos que debiliten esa fuerza de adherencia y eviten la infección viral. El investigador llama la atención hacia el hecho de que los microscopios de fuerza atómica convencionales, de los cuales se valió en 1991, empezaron a ser comercializados en 1989. Usados sobre todo por físicos y químicos, sirven, por ejemplo, para comparar las imágenes de diamantes sintéticos, empleados en brocas industriales, con las de diamantes naturales.
Pioneros
Fue solo en 1995, cuenta Pereira, que surgió el primer modelo aplicado al área biológica. El Bioscope, fabricado por Digital Instruments, de California, trae acoplado un microscopio óptico invertido y muestra su gran ventaja: mientras que en los microscopios electrónicos el fijador usado en la preparación de la muestra mata a las células, el de fuerza atómica puede analizar material vivo sin usar fijador (tetróxido de osmio o glutaraldeído o oro evaporado). Esa ventaja se presenta tanto en relación al microscopio electrónico de transmisión, que investiga el interior de la célula, como al de barredura, que realiza la topografía del material.
Pereira caracteriza al equipo en uso como el más moderno del género. Lanzado al final de 1998 por la empresa americana Thermomicroscopes, de California, el Bioprobe fue comprado en abril de 2000 después de nueve meses de negociación: su precio inicial, de 135 dólares mil, bajó a 100 mil, pues – como Pereira argumentó -, además de ser el primero y único vendido a Brasil, el fabricante obtendría propaganda indirecta cada vez que el investigador diera una conferencia o tuviera su trabajo destacado.
Debido a los múltiples recursos del equipo, Pereira lo considera más apropiado para el análisis tridimensional de proteínas que el microscopio de fuerza atómica convencional usado por el Laboratorio de Luz Sincrotón del Ministerio de Ciencia y Tecnología, en Campinas: “El microscopio instalado en el Sincrotón es apropiado para el área de física y química, pero no permite la localización precisa del cristal de proteína, porque la búsqueda es realizada con el movimiento de la sonda a ciegas. El microscopio que uso es el mejor que existe para todo tipo de análisis en el área biológica, lo que no quiere decir, de ninguna manera, que mi laboratorio sea mejor que el Sincrotón, una referencia en investigación”. La operación del microscopio requiere de una estación de trabajo conectada a una computadora y compuesta por el microscopio, un televisor y un monitor de video de alta definición.
Funcionamiento
El aparato usa solamente un haz de radiación láser de baja potencia, que mantiene viva a la muestra. Ese haz incide sobre la microestructura llamada cantilever. Similar a una escuadra de dibujo, el cantilever tiene un lado que mide cerca de 100 micrones. Como cada micrón equivale a un milésimo de milímetro, ese lado tiene el espesor promedio de un cabello. El cantilever está constituido por dos láminas, una de silicio abajo y otra de oro espejado arriba. El láser incide en la parte espejada y es captado por una fotocélula o fotodiodo, componente electrónico que transforma la energía lumínica en energía eléctrica. Los impulsos eléctricos son transportados a la computadora, que los transforma en imágenes digitales.
En la parte de abajo del cantilever hay una punta o sonda, que barre la superficie y, a medida que recorre su topografía, altera la dirección del haz de láser para llegar a áreas diferentes de la fotocélula. Ese desplazamiento del haz produce mayor o menor cantidad de impulsos eléctricos. El número de impulsos enviados a la computadora define áreas más claras o oscuras, según la programación del software: en este caso, se convino que, cuanto más alta fuera la topografía, más clara sería la imagen. Lo que se observa en una pantalla de computadora de alta definición son imágenes tridimensionales semejantes a montañas, en un relieve más o menos accidentado, según las variaciones suaves o abruptas de la topografía de la muestra. Encima del lugar reservado a la muestra en análisis, se ubica en el Bioprobe una caja plástica azul – el color del instrumento – en la cual se inserta una pequeña pieza que contiene el cantilever. Abajo de la muestra, en posición invertida, hay un microscopio óptico: el mismo se ubica sobre la muestra para captar tanto la imagen del material analizado como la posición del cantilever. Junto a la muestra, una cámara transmite al televisor las imágenes microscópicas del cantilever en movimiento.
Búsqueda de calcio
Resta saber cómo Pereira construye los biosensores con la sonda del microscopio para mapear canales iónicos en la superficie de las células. Tómese como ejemplo la búsqueda de canales de iones calcio, importante para el desarrollo de medicamentos para cardíacos. Pereira pone en la punta del cantilever un bloqueador de iones calcio: es un medicamento para el corazón, que puede ser nifedipina o uno de sus derivados – nitrendipina, nicardipina o amilodipina. Después, pasa el cantilever sobre células de Saccharomyces cerevisae – la levadura de panadería -, que hacen las veces de modelo experimental porque tienen canales de calcio similares a los de las células humanas.
Para explicar lo que ocurre a posteriori, Pereira recuerda la existencia de las llamadas fuerzas de Van der Waals: son fuerzas muy débiles, que corresponden a las ligaciones tiemporarias que se establecen siempre que dos materiales, vivos o inertes, entran en contacto. Por ejemplo, cuando caminamos, surgen fuerzas de Van der Waals entre nuestros zapatos y el piso. Claro que son muy débiles, de lo contrario no saldríamos del lugar. Lo mismo ocurre cuando apoyamos la mano en una mesa u otro material.
Entonces, cuando el bloqueador de iones calcio acoplado a la punta del cantilever encuentra un canal de calcio, la afinidad entre ambos eleva levemente la intensidad de la fuerza de Van der Waals en el local, atrayendo al cantilever hacia abajo y alterando la dirección del haz de láser que va a alcanzar la fotocélula. Una alteración tan pequeña no impide al cantilever desprenderse y continuar su exploración de la muestra. Cuando el mismo sale del canal de calcio, la fuerza de Van der Waals diminuye nuevamente y altera en consecuencia la dirección del haz de láser. Resultado: el microscopio produce un gráfico de la variación de esas fuerzas de interacción entre el medicamento y los receptores en la célula: los canales de calcio buscados.
Fabuloso
Graduado en la Facultad de Farmacia de la Universidad Federal de Ouro Preto (Ufop, Minas Gerais), Pereira realizó su maestría en Bioquímica en el área de metabolismo de drogas de la Unicamp, donde también se doctoró en Química Orgánica en el área de síntesis de medicamentos. Realizó su posdoctorado en microscopía de fuerza atómica en la Escuela de Medicina de la Universidad Yale (Estados Unidos). El investigador sitúa los estudios que desarrolla muy cerca de los de Hermann E. Gaub, del Departamento de Física de la Universidad Técnica de Munich, Alemania, y de Julio Fernández, de la Clínica Mayo, en Rochester, Estados Unidos. Ambos miden la fuerza de interacción entre moléculas biológicas.
Por su metodología de investigación en células vivas, Pereira fue disertante invitado en el IV Pharmatech (Congreso de la Sociedad Brasileña de Tecnología Farmacéutica – SBTF) en 1999, y tuvo uno de sus resultados con modelado molecular publicado en la capa del libro de resúmenes del congreso. Los resultados obtenidos con el microscopio de fuerza atómica merecieron una mención en el libro texto Yeast Physiology and Biotechnology, de Graeme Walker, publicado en Inglaterra, y fueron tapa de la revista norteamericana Applied Biochemistry and Biotechnology, informa Pereira.
En octubre del año pasado, estuvo en Estados Unidos para aprender más sobre las potencialidades del aparato. En abril irá a Toronto, Canadá, para conocer un nuevo tipo de microscopio, el Somatoscope: “Ese fabuloso equipo logra visualizar el interior de células vivas con una resolución de hasta 150 angströns” (1 angström = 10 – 8 cm, es la unidad de longitud de la onda de luz). Es decir, “en la misma línea del Bioprobe, en el sentido de visualizar material biológico sin uso de fijador o colorante”.
EL PROYECTO
Utilización de Biosensores Hechos con la Sonda del Microscopio de Fuerza Atómica Aplicado al Área Biológica para Mapear Canales de Iones en la Superficie de Células
Modalidad
Programa Jóvenes Investigadores
Coordenador
Ricardo de Souza Pereira – Instituto de Ciencias Biomédicas de la USP
Inversión
R$ 78.240,42 y US$ 110.449,00
