Prêmio CBMM
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Zootecnia

El ternero inesperado

Debido a un equívoco, nace el primer clon brasileño surgido de célula somática de feto

EDUARDO CESARMarcolino, el clon: desarrollado por engaño, anticipó el objetivo del grupo de la USPEDUARDO CESAR

Viernes 27 de abril de 2002, Estancia Panorama, Campinas. En la sala de parto, todos en sus puestos y una gran expectativa. Se ponía en marcha algo más que una cesárea: se trataba de traer al mundo a la primera becerra clonada a partir de una célula adulta de una vaca de la raza nelore. El equipo de José Antônio Visintin, de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de São Paulo (USP), encargado del proyecto, aguardaba impaciente. Finalmente nació: pero, en lugar de la esperada ternera, era Marcolino, un fuerte y sanísimo macho.

Estaban todos eufóricos con el éxito y atónitos por la sorpresa. “Es imposible generar un clon macho a partir de una célula adulta de una hembra, pues el sexo ya está definido en la célula somática”, aclara Visintin, que coordina dos investigaciones de clonación bovina: una con células adultas y la otra con células de fetos. El equipo trabajó duro durante dos años, turnándose durante las 24 del día para chequear células y fases del proceso de clonación cada dos horas.

Con ese empeño y con los datos controlados, Visintin descubrió rápidamente la razón del misterio: “Chequeé todos los procedimientos utilizados durante dos años y descubrí que, el día 20 de junio, fueron congelados dos grupos de células: uno de células adultas de hembra y otro de células de feto. Pese a todos los cuidados, probablemente alguien más afectado por la fatigante rutina del proceso embaló células de feto creyendo que fueran células de adulto”. Son gajes del oficio: es la ciencia exhibiendo su realidad. Como el equipo realiza fecundación in vitro hace seis años, sin problemas anteriores, solo podía tratarse de un cambio accidental. Pero era preciso comprobarlo.

Una vez descartada la posibilidad de que la vaca hubiera sido fecundada por un toro, se realizó el análisis de ADN en muestras de la nelore donadora, de la vaca receptora, del recién nacido, del cultivo de células de la donadora y del cultivo de células de feto. Con la ayuda del equipo de José Fernando Garcia, de la Universidad Estadual Paulista (Unesp) de Araçatuba, integrante del Proyecto Genoma, y con los análisis efectuados por el laboratorio LinkGen, el mapeamiento genético lo confirmó: Marcolino es un clon proveniente de una célula de feto, lo que comprueba el cambio involuntario.

Anticipación
“Nuestra idea era desarrollar primero el clon de célula adulta: tendríamos tiempo hasta el final de 2002 para hacerlo. Solamente después daríamos consecución a la clonación de la célula somática del feto”, revela Visintin. De esta manera, el engaño invirtió las investigaciones y anticipó los objetivos. “Lo más importante”, acentúa el investigador, “es que hicimos el primer clon de célula somática en Brasil y probamos que contamos con la tecnología para producirlo. Un resultado diferente al alcanzado por Embrapa de Brasilia, que produjo una hembra clonada de una célula embrionaria.”

Para Visintin, el objetivo de la clonación es reproducir animales en extinción o de alta producción, al margen de multiplicar animales transgénicos más fácilmente. Se puede, por ejemplo, reproducir vacas lecheras más productivas y transgénicos que produzcan grandes cantidades de componentes de interés farmacológico -como es el caso de los factores 8 y 9 de coagulación, muy importantes en el tratamiento de hemofílicos, y que pueden ser producidos en la leche. “Dado que las vacas no tienen Sida, esos factores podrían ser retirados y suministrados al hombre sin los riesgos de las transfusiones de sangre.”

El proceso
El primer paso del equipo consistió en extraer y cultivar células de la oreja de una vaca nelore adulta. Simultáneamente se efectuó el cultivo de células de fetos sin raza definida, con entre 45 y 60 días de gestación y entre 20 y 30 centímetros de longitud, recogidos en mataderos inmediatamente después del retiro de las vísceras de vacas faenadas. Los fetos fueron colocados en una solución, en recipientes apropiados para la conservación de las células, y transportados al laboratorio de la Facultad de Veterinaria, hasta 3 horas después de la muerte de la vaca como máximo. Una vez limpios, se los colocó en el medio de cultivo. Los fibroblastos obtenidos en los dos cultivos fueron congelados por separado.

Paralelamente, se recogieron los ovarios de vacas faenadas en el matadero y se aspiraron sus oocitos (óvulos) en el laboratorio. De los que ya estaban maduros, se retiraron los núcleos, obteniéndose así células enucleadas (sin su ADN nuclear). Un fibroblasto de cultivo, privado del suero fetal bovino durante dos días, en estadio G cero (inicio del desarrollo de la célula), fue luego insertado en el óvulo enucleado. Se le aplicó un estímulo eléctrico, lo que desencadenó una reprogramación celular del citoplasma: las células empezaron a dividirse. Transcurridos entre siete y ocho días de cultivo, se llegó al estadio de blastocisto, con el inicio de la formación de las células de la placenta y del botón embrionario. Entonces el futuro clon fue transferido al útero de la vaca de alquiler, dando secuencia a la gestación de nueve meses.

Pero se producen pérdidas en todas las fases de ese proceso. De cada 100 oocitos recogidos, por ejemplo, solamente alrededor del 80% madura. En el retiro del núcleo, se produce una nueva pérdida de cerca de un 50%, restando así cerca de 40 oocitos enucleados. Luego de la inserción del fibroblasto y del shock eléctrico, solamente la mitad de los oocitos se funde, lo que permite el cultivo de 20 de éstos. De estos, finalmente, apenas unos cinco se desarrollan y llegan a la fase de blastocisto para su implantación en las vacas.

Una vez iniciada la gestación, también hay pérdidas. Los períodos más críticos -con gran incidencia de mala fijación y abortos- aparecen durante los primeros 20 días de gestación, en la fase siguiente entre 20 y 50 días y a los 90 días. Y a veces el becerro muere al nacer, producto de la malformación de sus órganos. “Marcolino es el primer éxito en dos años de investigación”, dice Visintin. “De 16 implantes de blastocistos, conseguimos cuatro gestaciones. Una de éstas resultó en un aborto y tenemos otras dos vacas preñadas con clones producidos por mi equipo: una está de seis meses y otra lleva dos meses de gestación.”

Visintin recuerda que el índice de pérdidas produce reflexiones importantes, ya que las investigaciones con humanos siempre surgen luego de las investigaciones con animales: “Si hoy en día la fecundación humana in vitro está bien desarrollada, esto se debe a que ese proceso es usual en animales desde hace muchos años”. Con una diferencia esencial: “En la clonación bovina, todavía en las fases iniciales, si algo sale mal, se puede sacrificar al animal”.

Dos laboratorios
Una vez obtenidos los clones de células adultas y fetales, el grupo comparará el desarrollo de ambos para responder ciertas cuestiones: “¿El clon originado en una célula adulta ya nace viejo? ¿Si de una célula hago dos o tres, esas células clonadas obtenidas a cada división también envejecen?” Para saber todo esto, es preciso obtener lo más rápidamente posible un clon de una célula adulta. “Vamos a poner a disposición estos los clones para estudios de fisiología (bioquímica y sexual) y genética”. El equipo de Maria Angélica Miglino, del Departamento de Anatomía de la Facultad de Veterinaria, analizará las placentas de cada gestación para verificar forma, composición y función, con relación a placentas de gestación normal, lo que debe contribuir para descubrir las razones de los fracasos.

Para cerciorarse de que no se produzca ningún nuevo accidente, el investigador de la USP procedió a la separación total de los laboratorios: uno solamente para la clonación de células adultas y otro para la de células fetales. Vinsintin espera que, con el éxito de la segunda fase anticipado, los artículos sobre Marcolino y su estudio molecular puedan estar listos para su publicación antes de fin de año.

Los Proyectos
Maduración y Fertilización de Oocitos y Co-Cultivo de Cigotos Bovinos en Cultivo Primario de Células Epiteliales de Oviducto de Bovinos y Linajes Permanentes
Inversión
R$ 127.290,00
Clonación de Embriones Bovinos: Desarrollo de la Técnica de Transferencia Nuclear
Inversión
R$ 312.716,01
Modalidad
Línea regular de auxilio a la investigación
Coordinador
José Antônio Visintin – Universidad de São Paulo

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