LÉO RAMOSPlántulas de caña de azúcar transgénica en el Instituto de Química de la USPLÉO RAMOS
Los ancianos dirían que a la caña de azúcar se la está poniendo del revés, dado el volumen de estudios genéticos, fisiológicos y agronómicos a los que se la está sometiendo durante los últimos años. Lo que se desea es conocer con mayor profundidad a la planta y sus peculiaridades, con la intención de elevar la productividad de esta gramínea que llegó a Brasil de la mano de los portugueses precisamente en el siglo XVI. El objetivo final es producir más etanol por hectárea de tierra. Para ello también sirven las investigaciones para adaptar mejor la caña a la denominada segunda generación de producción de alcohol, cuando las enzimas aprovecharán los azúcares que se recuperen del bagazo de caña para la formación de una especie de sopa y así producir un mayor volumen de biocombustible. De este modo, investigadores pertenecientes a varias instituciones brasileñas tienen la mira puesta tanto en la investigación básica como más adelante, en el futuro del proceso industrial de producción de etanol. El avance del conocimiento científico comenzó en 1999 con el lanzamiento del Genoma Caña, financiado por la FAPESP, y el último resultado de las investigaciones confirma que el culmo o tallo y las hojas de la caña poseen más azúcares ‒las sustancias primordiales para la elaboración del etanol‒ en su parte compuesta por hemicelulosa que en la de celulosa; un conocimiento que futuramente puede modificar el rumbo de la producción de etanol de segunda generación.
“Realizamos estudios de las paredes celulares, tanto del tallo como de las hojas de la caña, que revelaron la presencia de alrededor de un 30% de azúcares en la celulosa y un 50% en la hemicelulosa, además de un 10% de pectinas. La tecnología que se está desarrollando ahora para el futuro etanol de segunda generación, se basa tan sólo en la celulosa, mientras que los polímeros de azúcares de la hemicelulosa, que contienen azúcares complejos tales como el arabinoxilano, betaglucano y xiloglucano, son desechados, además de las pectinas, que en conjunto, representan un 70% de los azúcares de las paredes celulares de la caña”, dice Marcos Buckeridge, docente del Instituto de Biociencias de la Universidad de São Paulo y coordinador del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología (INCT) del Bioetanol, que agrupa a 31 laboratorios en cinco estados brasileños. En las paredes celulares de la caña, la hemicelulosa y la pectina, localizada entre las microfibrillas, que son conglomerados de moléculas de celulosa, poseen muchos azúcares compuestos por cinco carbonos y por eso no son apetecibles para las levaduras (Saccharomyces cerevisiae) utilizadas para la fermentación del jugo de caña. Éstas están acostumbradas a la sacarosa, formada por glucosa y fructosa, que se encuentra en el jugo de caña, o incluso en la glucosa de la celulosa y de algunas de las hemicelulosas, que poseen seis carbonos.
El futuro aprovechamiento, por medio de la hidrólisis de las pentosas del bagazo, que son los azúcares con cinco carbonos, puede conducir a un aumento en el etanol estimado de al menos otros 5 mil millones de litros para la producción brasileña (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 192), que actualmente es de unos 25 mil millones de litros. La utilización de las pentosas también podría ocurrir mediante su uso en aplicaciones biotecnológicas, en alimentos y en medicamentos, agregándole así valor comercial al bagazo. En los procesos de segunda generación, las enzimas forman un líquido que también les sirve como alimento a las mismas levaduras. “Hay intentos para producir linajes de Saccharomyces, incluso en el Laboratorio Nacional de Ciencia y Tecnología del Bioetanol (CTBE), y en otras instituciones y empresas de Brasil y del exterior, que sean capaces de aprovechar los azúcares con cinco carbonos. En Inglaterra y en Suecia ya se ha logrado demostrar que eso es posible, aunque todo lo que se ha hecho fue en un laboratorio esterilizado. Con todo, esto aún no resulta suficiente para los ingenios brasileños. Es necesario que las levaduras tengan fortaleza, para sobrevivir en presencia de otros microorganismos, tales como las bacterias, que existen en un ambiente sin esterilización”, dice Buckeridge, quien también es director científico del CTBE, ubicado en Campinas, São Paulo.
Incluso en los experimentos relacionados con la etapa más avanzada, que es la hidrólisis de la celulosa, aún subsisten muchas dudas. “Existe un conocimiento cabal del proceso de previo al tratamiento, pero todavía hay que investigar las distintas opciones para realizar la hidrólisis de una forma en que la industria pueda aprovecharla rápidamente y de modo económico y sostenible”, dice el profesor Rubens Maciel Filho, de la Universidad Estadual de Campinas (Unicamp), uno de los coordinadores del Programa FAPESP de Investigación en Bioenergía (Bioen), en el cual el INCT Bioetanol también participa. “Hay que evaluarlo en cuanto a sus aspectos tecnoeconómicos y de sostenibilidad, en este caso, mediante el análisis del consumo de agua y del uso de productos químicos en el proceso de hidrólisis”, dice Maciel Filho.
Alexandre Affonso“Actualmente, en los experimentos para la segunda generación, el bagazo, luego de descartárselo tras la primera generación, cuando se extrae el jugo de la caña para fabricar etanol, pasa por un proceso de ruptura de las paredes celulares para la obtención de la celulosa que se encuentra dentro de la hemicelulosa y de la lignina, un polímero que no posee azúcar”, dice Buckeridge. Esa ruptura se produce actualmente con vapor en alta presión: así la pared celular del bagazo se afloja y la separación de los componentes se realiza mediante solventes, ácidos y enzimas. “Se trata de utilizar la fuerza. Se realiza un esfuerzo para separar todo lo que está mezclado con la celulosa”, dice el profesor de la USP. “Nuestra idea es comenzar con el proceso de hidrólisis en campo. Producir una variedad de caña más adecuada a la segunda generación, que facilite la hidrólisis y ya no se necesite lavar el bagazo, con lo cual se desperdicia mucho del azúcar del material”.
En un artículo que se publicará en la revista BioEnergy Research, él y otros dos investigadores de su grupo en la USP, junto a dos investigadores del Centro de Carbohidratos Complejos de la Universidad de Georgia, en Estados Unidos, más allá de exponer la investigación que identifica las fracciones de cada polímero del azúcar en la caña, realizan observaciones sobre la complejidad de la pared celular y la dificultad para encontrar claves químicas o un código que pueda sacar mayor provecho de la red de polisacáridos. Ellos también consideran que el resultado de la composición de azúcares en la caña puede conducir a una modificación en el proceso de segunda generación. Basándose en datos actuales, Buckeridge imagina, como una solución posible para el futuro, que lo mejor sería que la caña se utilice entera en el proceso de hidrólisis luego de extraerse el jugo para la primera generación.
“La biología de las paredes celulares constituye la esencia de esos avances y resulta fundamental para lograr progresos tecnológicos en el área de los biocombustibles sostenibles y biomateriales”, dice el profesor Leonardo Gómez, del Departamento de Biología de la Universidad de York, Inglaterra. Gómez, que es argentino, visitó Brasil en 2010 para conocer el CTBE. “Según la opinión de muchos expertos, el desarrollo de biocombustibles de segunda generación se ve favorecido por la presencia de una industria afianzada de primera generación. De tal modo, Brasil se presenta como el mejor ámbito para que eso suceda. Aunque tan sólo potencialmente, puesto que alguien debe asumir el riesgo de invertir en el área a escala industrial”, dice Gómez.
En la práctica, para poder avanzar en el proceso de obtención de etanol de segunda generación, Buckeridge destaca un tratamiento fisiológico previo que deja a la planta más maleable y potencialmente más adecuada para su procesamiento mediante la hidrólisis. “Se trata de una sustancia que, al aplicarse en las plantaciones cuando las plantas todavía son pequeñas, inhibe una enzima en la caña que generaría fenilpropanoides, que son los precursores de la lignina, la sustancia que une los azúcares a la pared celular y confiere resistencia mecánica a la planta. Todavía no sabemos con certeza lo que sucede, pero mediante este compuesto ha sido posible aumentar en un 30% el procesado de los xilanos, que abarcan a un 50% de las hemicelulosas”, dice Buckeridge. El uso de esta sustancia compuesta por ácido piperonílico en la caña cuenta con una patente depositada por Buckeridge en el Instituto Nacional de la Propiedad Intelectual (INPI), juntamente con su ex posdoctorando Wanderley dos Santos, quien actualmente, como profesor en la Universidad Federal de Paraná (UFPR), prueba en campo el producto. “Todavía debemos perfeccionarlo e intentar abaratar su costo”, dice Buckeridge.
INCT-BIOETANOLImágenes microscópicas para el análisis de las hojas de la caña (en la columna de la izquierda) y del tallo (a la derecha). Fluorescencia aplicada en las células (banda central) y la presencia de lignina (en rojo, en la banda inferior), donde también pueden detectarse varias células intactas, con formato circular, y repletas de jugoINCT-BIOETANOL
Otra solución para la segunda generación se está elaborando en el seno del Bioen, donde 13 grupos de investigadores colaboran para desarrollar una supercaña, una o más variedades agronómicas y genéticas con características de alta calidad, tanto para la primera como para la segunda generación. Una de esas características consiste en que cuente con una mayor capacidad para realizar fotosíntesis. Los investigadores han identificado al menos cuatro genes responsables de captar la luz solar. Estos genes podrían relacionarse con el aumento en la tasa de crecimiento de la cantidad de células con el consiguiente incremento en la producción de sacarosa. La configuración de plantas transgénicas se encuentra entre las herramientas biotecnológicas destinadas a la producción de esa supercaña. Lo transgénico, en tal caso, no estaría dado solamente por la inserción de genes externos a la planta, sino también por la activación o inhibición de los genes de la propia caña. “También podríamos elaborar plantas con paredes celulares más adecuadas para la segunda generación”, dice Buckeridge. “Puede parecer futurista pensar así, pero el Bioen cuenta con genes relativos a la pared celular transformada, con los que planeamos elaborar la ‘caña papaya’, por ejemplo”. Esa caña del futuro tendría algunas características similares a la papaya, que es más dulce y blanda luego de su maduración y cosecha.
“Hemos identificado 380 genes ligados a la sacarosa y más de mil relacionados con la resistencia a la sequía”, dice la profesora Glaucia Mendes Souza, del Instituto de Química (IQ) de la USP, quien junto con la profesora Marie Anne van Sluys, del Instituto de Biociencias de la USP, dirige la investigación genómica de la caña de azúcar en el ámbito del Bioen y cuenta con la participación del profesor Marcelo Menossi, del Instituto de Biología de la Universidad Estadual de Campinas (Unicamp). 250 de esos genes ya están siendo testeados en plántulas de caña dispuestas en tubos de ensayo, cubetas y macetas en el IQ de la USP o en viveros de la Escuela de Agricultura Luiz de Queiroz, de la USP, en Piracicaba, en experimentos que coordina la profesora Helaine Carrer, quien analiza la expresión de los genes. También se prueba la expresión de genes de caña en tabaco, una planta más fácil de manipular en laboratorio y que sirve como modelo para este tipo de experimento. Dos genes de la caña relacionados con la resistencia a la sequía ya fueron expresados en el tabaco y su utilización derivó en una patente depositada en el INPI.
Para modificar una planta con genes de interés se necesitan promotores, que son herramientas biotecnológicas bajo la forma de secuencias de ADN donde el gen se expresa. Es en esas moléculas que los investigadores modularán la superexpresión o silenciarán genes. “Este año depositamos una patente sobre 10 promotores de la caña que permitirán la expresión de los genes en forma diferente”, dice Mendes Souza. En relación con las paredes celulares de la caña, ella dice que ya desarrolló plantas con genes silenciados que estaban relacionados con la producción de lignina. “La lignina obstruye la ejecución de la segunda generación pues dificulta la extracción de los polisacáridos, pero cuando impedimos su producción, se detectó en algunos experimentos, un debilitamiento que provocó la caída de la planta hacia los costados. Tenemos que encontrar variedades en que podamos experimentar un término medio, disminuyendo la producción de lignina, pero manteniendo la planta en pie”, explica Mendes Souza.
LÉO RAMOSPlántulas transgénicas: herramientas biotecnológicas que comprenden estrategias para silenciar o activar genes de la propia caña de azúcarLÉO RAMOS
En el otro extremo de la investigación académica relativa a la hidrólisis, se encuentran los estudios destinados a obtener enzimas cada vez más eficientes para romper las paredes celulares de la caña, extraer los azúcares y preparar el material para la producción de etanol. Pero, ¿qué enzimas utilizar para procesar los diferentes polisacáridos presentes en la pared celular de la planta? Algunas enzimas que se utilizan en la industria alimenticia, por ejemplo, se están probando para la caña, pero éstas no lo resuelven todo. “Estas enzimas industriales son producidas principalmente por hongos”, dice el profesor Richard Ward, del Departamento de Químic, de la Facultad de Filosofía, Ciencias y Letras de Ribeirão Preto, de la USP, y del CTBE, quien ya logró configurar dos enzimas multifuncionales que actúan sobre las hemicelulosas. Estas enzimas, a las que se denominó quiméricas, son producidas por bacterias.
“Sabemos que la celulosa es un componente más esquivo a la hora de extraerlo que los otros polisacáridos presentes en la pared celular de la caña, y nuestro reto consiste en crear enzimas que destruyan y degraden, de manera programada, a los otros componentes, que también son fuentes importantes de azúcar, hasta llegar a la celulosa”, explica Ward. “Resulta importante desarrollar las enzimas más adecuadas para cada polisacárido. Pero todavía parece difícil encontrar enzimas adecuadas y con bajo costo. Actualmente se las comercializa por decenas de dólares el kilogramo. Puede parecer barato, pero debemos pensar en un procesamiento en centrales de centenares o hasta miles de toneladas de material lignocelulósico al día”. Ward dice que el objetivo consiste en elaborar enzimas quiméricas, donde cada una ataque a más de un polímero del bagazo de caña. “Esto resulta importante principalmente para las hemicelulosas, que poseen un conjunto heterogéneo de polisacáridos”.
También surgen investigaciones en relación con las enzimas a las que se podría caracterizar como insólitas, aunque basadas en la más pura observación de la naturaleza. En la búsqueda de enzimas que disuelvan la celulosa y el material lignocelulósico, tal como el bagazo, el profesor Ednildo Machado, del Instituto de Biofísica, de la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ), estudia la composición enzimática del sistema digestivo de dos cucarachas, la Periplaneta americana, común en las grandes ciudades, y la Nauphoeta cinerea, criada para servir de alimento a animales en cautiverio, tales como lagartos y otros reptiles. “En experimentos de laboratorio llegué a suministrar tan sólo bagazo de caña a las cucarachas y éstas se alimentaron con él, o sea, lograron digerir las paredes celulares de ese material para sobrevivir de manera muy exitosa”, dice Machado. Al constatar eso, comenzó a pensar en las posibles enzimas del aparato digestivo de esos insectos que pueden ser útiles para la producción de etanol de segunda generación.
Machado fue presentado a Buckeridge en ocasión del Congreso Brasileño de Bioquímica en 2010, y a partir de allí comenzaron a trabajar junto. Él visitó el CTBE y realizaron varios experimentos. “Logramos detectar algunas enzimas producidas por bacterias en el interior del sistema digestivo de las cucarachas. No sabemos todavía si esas bacterias ya estaban allí o si el insecto las extrajo del material, en ese caso, del bagazo”. Las cucarachas también pueden producir las enzimas por medio de hongos y protozoarios, y poseen gran facilidad para alimentarse con una amplia gama de residuos, más allá de que se adaptan fácilmente a esa diversidad. “Esta característica nos permitió identificar una serie de enzimas en los insectos, que resultan excelentes para diversos procesos tecnológicos”, dice Machado. El próximo paso consistirá en identificar con exactitud cuáles son los microorganismos que producen las enzimas. Para ello se necesita secuenciar todos los ADN presentes en el intestino de la cucaracha, mediante un proceso denominado metagenómica, que permite detectar qué especies y qué genes están involucrados en la producción de enzimas especializadas en la división de la celulosa y la hemicelulosa del bagazo de caña. Mediante la identificación de los genes, es posible clonarlos en bacterias tales como la Escherichia coli, y así posibilitar la producción de dichas enzimas en escala industrial. Este proceso es el que está comenzando a utilizar el profesor Ward para producir en laboratorio las enzimas destinadas a degradar la pared celular de la caña.
De esta manera se incrementa el arsenal de herramientas que podrían colaborar, dentro de algunos años, para que la caña de azúcar produzca mayor cantidad de etanol. “Durante los últimos 10 años se ha producido un aumento exponencial de la investigación y la inversión en tecnología destinada a la utilización de la biomasa como un sustituto renovable y sostenible del petróleo”, dice Gómez, de la Universidad de York. “La investigación actual en el área de composición de la biomasa dota de nuevo potencial a la energía biorrenovable”. En su opinión, la producción de etanol y de productos químicos con alto desempeño a partir de la biomasa, solamente resulta posible mediante el conocimiento minucioso y multidisciplinario de la biología y bioquímica de la biomasa.
Proyectos
1. Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología (INCT) del Bioetanol (nº 2008/57908-6); Modalidad Proyecto Temático del Programa FAPESP de Investigación en Bioenergía (Bioen); Coordinador Marcos Silveira Buckeridge – USP; Inversión R$ 2.896.588,59 e US$ 303.342,92 (FAPESP)
2. Sugarcane signaling and regulatory networks (nº 2008/52146-0); Modalidad Proyecto Temático del Programa FAPESP de Investigación en Bioenergía (Bioen); Coordinadora Glaucia Mendes Souza – USP; Inversión R$ 3.390.743,73 e US$ 1.174.768,67 (FAPESP)
3. Identificación, caracterización e ingeniería de enzimas que degradan la pared celular de las plantas (nº 2010/18850-2); Modalidad Proyecto Temático; Coordinador Richard John Ward – USP; Inversión R$ 491.952,05 e US$ 313.495,03 (FAPESP)
Artículos científicos
DE SOUZA, A.P. et al. Composition and structure of sugarcane cell walls: implications for cell wall hydrolysis and second generation bioethanol. BioEnergy Research. In press. sept. 2012.
BEGCY, K. et al. A novel stress-induced sugarcane gene conferstolerance to drought, salt and oxidative stress in transgenic tobacco plants. Plos One. v. 7, n. 9, e44697. sept. 2012.
FURTADO, G.P. et al. A designed bifunctional laccase/ b-1, 31, 4 – glucanase enzyme shows synergistic sugar release from milled sugarcane bagasse. Protein Engineering, Design & Selection. In press. sept. 2012.
