Shaker Chuck Farah, un bioquímico canadiense que desde hace15 años vive en São Paulo, apunta en la pantalla de la computadora hacia un conjunto de círculos concéntricos definidos por una sutil variación de tonos grises. Puntos negros salpican el centro del monitor y forman una imagen que se asemeja a un blanco perforado de balas. Es la firma de luz de una proteína producida por la Xanthomonas axonopodis pv citri, la bacteria causante del chancro cítrico, una de las peores plagas de la citricultura brasileña. Al atravesar un cristal de la proteína, un haz de rayos X sufre desvíos y registra en el detector puntos que permiten identificar la estructura tridimensional de esta molécula. Por medio de esta técnica llamada difracción de rayos X, el equipo del bioquímico de la Universidad de São Paulo (USP) definió, átomo por átomo, la estructura en relieve de la YaeQ: sus 182 bloques esenciales (aminoácidos) se agrupan y se modelan un barril sin tapas, con una hendidura en lo alto.
La YaeQ es sólo una de las 52 moléculas cuya estructura espacial fue descrita durante los dos últimos años por los investigadores de la Red de Biología Molecular Estructural, el Smolbnet, sigla en inglés de Structural Molecular Biology Network. Creada en diciembre de 2000 bajo la coordinación del bioquímico Rogerio Meneghini, con apoyo de la FAPESP y del Laboratorio Nacional de Luz Sincrotrón (LNLS), esa red empieza ahora a cosechar los principales resultados de análisis de proteínas, al cabo de cuatro años y medio de trabajo. Sucede que primero fue necesario formar a biólogos, bioquímicos, químicos y médicos de 20 laboratorios paulistas en las técnicas adoptadas para descubrir la forma tridimensional de esas moléculas, esenciales para la composición y el funcionamiento de los organismos vivos.
Dos características de esta red hicieron que la tarea se volvería más difícil. La primera es que los equipos desempeñan actividades distintas unas de las otras. El grupo del médico Ismael Silva, por ejemplo, estudia proteínas ligadas al surgimiento de cánceres ginecológicos, mientras que el equipo del que el biólogo Luis Eduardo Soares Netto es jefe investiga un conjunto de proteínas que protegen a las células de los radicales libres. En tanto, la bióloga Carla Columbano de Oliveira analiza la estructura de las proteínas componentes de un aglomerado – el exosoma – existente en el núcleo de las células, responsable por el control de calidad de las moléculas de ácido ribonucleico (ARN) que, entre otras tareas, copian la información de los genes y orientan la producción de otras proteínas. La segunda cosa que complica es que casi todos los grupos tenían poco o ningún conocimiento sobre las técnicas de determinación de la estructura de las proteínas. “Nuestro objetivo era enseñarles el proceso de investigación de la forma tridimensional de las proteínas a los equipos de investigadores que frecuentemente se deparan con la necesidad de conocer la estructura de estas moléculas”, afirma Meneghini, quien dirigió entre 1997 y 2004 el Centro de Biología Molecular Estructural (Cebime) del LNLS.
Múltiplas técnicas
El esfuerzo valió. En los últimos dos años los diferentes equipos determinaron la estructura de 24 proteínas por la difracción de rayos X – la principal técnica usada en el estudio de los cristales de esas moléculas, la cristalografía de proteínas. Entre ellas, hay dos importantes proteínas que inhiben en etapas diferentes la coagulación de la sangre y, en el futuro, podrán aplicarse en los tratamientos de infarto y trombosis. Los investigadores también llegaron a la forma tridimensional de otras 14 proteínas con una segunda técnica que usa rayos X, pero es menos precisa que la anterior: la dispersión a bajo ángulo, el Small Angle X-Ray Scattering (Saxs). Por medio de una tercera técnica, la resonancia magnética nuclear, develaron la conformación de otras 14 moléculas.
Estos resultados, que salieron publicados en 50 artículos publicados en revistas internacionales, fueron considerados bastante buenos de acuerdo con la evaluación realizada en octubre de 2004 por una comisión independiente, integrada por expertos del Instituto Pasteur de Francia, la Universidad de Oxford, Inglaterra, y el Laboratorio Nacional Brookhaven, Estados Unidos. “El índice de éxito desde la obtención de los clones hasta la determinación de las estructuras es comparable con el de proyectos internacionales”, afirmaron los examinadores extranjeros. Éstos también reforzaron la necesidad de instalar en el LNLS otra línea de rayos X, que provee radiación más intensa en longitudes de onda específicas. Esencial para identificar la estructura de proteínas desconocidas, esta línea, denominada MAD (Multiwavelength Anomalous Dispersion), entrar en operación antes del final de este año.
Era efectivamente necesario crear una red como ésta. Hasta el final de la década de 1990 eran contados los laboratorios brasileños dedicados a la cristalografía de proteínas, con relevancia para el grupo del cristalógrafo Glaucius Oliva, del Instituto de Física de São Carlos, ligado a la USP, y el propio Cebime. Al reducir ese histórico desfase, los equipos de otros 20 laboratorios son capaces de recorrer solos al menos cinco de las seis etapas de este proceso. “A juzgar por los resultados obtenidos, este programa constituyó un importante estímulo para el desarrollo del área en el país”, comenta Meneghini, quien actualmente es investigador del Centro Latinoamericano y del Caribe de Información en Ciencias de la Salud (Bireme).
Opacada por la notoriedad conquistada por el secuenciamiento del genoma de 180 organismos, la cristalografía reasume ahora en todo el mundo el papel primordial que siempre desempeñó en el estudio de la función de las proteínas. Esto se explica: la conformación espacial de estas moléculas determina el papel que ejercerán. Una proteína es producida en el interior de las células por el añadido de un aminoácido después otro, en una larga cinta compuesta esencialmente por átomos de hidrogeno, carbono, nitrógeno y oxígeno. Tan pronto como se forma, esta cinta empieza a sufrir torsiones y a doblarse sobre sí misma, asumiendo así una forma espacial a causa de la atracción y la repulsión ejercida por las cargas eléctricas de determinados tramos de la molécula.
El resultado de este ballet solitario son moléculas con forma de cordel, de globo o hasta de ampolla. Como una llave que abre únicamente una cerradura, las proteínas tienen una estructura espacial tan específica que en general sólo interactúan con otras moléculas en forma complementaria. “Fue la forma tridimensional del ADN lo que le indicó a James Watson y Francis Crick cómo esta molécula se comportaba”, comenta Farah. ¿Y qué le dice la forma de barril con hendidura aal bioquímico de la USP al respeto de la función de esta proteína? Farah todavía no lo sabe. La comparación con otras proteínas sugiere que la YaeQ es completamente diferente a lo que se conocía hasta ahora. “Este es el nuestro próximo desafío”, afirma el bioquímico de la USP. “Estamos siguiendo el camino inverso al recorrido tradicionalmente”, dice Farah. En general se usa la cristalografía para develar la estructura de las proteínas con funciones conocidas, pero, con la conclusión de varios genomas, ha crecido el número de proteínas cuyas funciones aún no han sido identificadas.
Éxitos y frustraciones
La determinación de la forma tridimensional de las proteínas, más artesanal que el secuenciamiento de los genomas, es una tarea tortuosa, casi siempre compuesta de seis etapas y con un bajo índice de de éxito, en promedio del 5%. Sucede que cada fase presenta obstáculos, con una dificultad extra: no hay manera de prever cuál etapa saldrá bien o no ni por qué razón no funcionó, en lo que parece ser un regreso a las pruebas empíricas de ensayo y error. El primer paso consiste en escoger el gen encargado de la producción de una proteína y descubrir la secuencia de pares de bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina y guanina) que lo componen. Luego se intenta copiar el gen de la proteína del que se desea obtener un cristal.
Cuando todo va bien, los investigadores insertan el gen escogido en el material genético de una bacteria o una levadura, que habrá de producir la proteína en cantidad suficiente para las etapas siguientes. Con el trabajo a cargo de estos microorganismos, no resta más que aguardar. La próxima fase consiste en separar la proteína que se estudiará de las demás fabricadas por la bacteria o por la levadura – el filtrado puede durar semanas. Los pocos miligramos de la proteína purificada se diluyen en diferentes concentraciones de sales y alcoholes, depositados en decenas de recipientes sellados y distribuidos sobre placas rectangulares de acrílico, un poco mayores que un atado de cigarrillo. Y una vez más es preciso esperar.
En un proceso todavía poco comprendido por los investigadores, los millones de copias de la proteína empiezan perder agua y a acercarse unas a otras, formando un bloque en estado sólido. Con algo de suerte, las moléculas de la proteína se acomodan todas a la misma distancia una de las otras y con la misma orientación, tal cual un pelotón de soldados desplegado que aguarda instrucciones del comandante. Es el cristal de la proteína. Pero si la distancia entre una molécula y otra fuera irregular o la orientación de las copias de la proteína no fuera homogénea, surge un sólido disforme en el fondo del recipiente. Y no hay una receta fija. “Cada proteína requiere condiciones específicas – un poco más de determinada sal o un tanto menos de un cierto alcohol – para formar un cristal”, comenta la bióloga Andrea Balan, del Instituto de Ciencias Biomédicas de la USP, quien en alianza con Luis Carlos Ferreira, investiga la forma espacial de un conjunto de 18 proteínas de la Xanthomonas citri implicadas en el transporte de nutrientes hacia el interior de la bacteria.
Rompecabezas
Recién entonces es que tienen inicio las pruebas de difracción en el LNLS, en Campinas. En un imponente edificio de concreto, potentes imanes aceleran electrones a velocidades cercanas a la de la luz en el interior de un anillo circular. Cada vez que se los desvía para mantener el trayecto circular, los electrones liberan una luz muy intensa, la luz sincrotrón, compuesta de radiaciones que van del infrarrojo a los rayos gama. En un laboratorio conectado a este anillo de luz sincrotrón, los investigadores controlan mediante una computadora la orientación del cristal expuesto a los rayos X y hacen centenas de imágenes similares a las exhibidas por Farah, cada una de un ángulo diferente. Un programa de computadora analiza las imágenes y genera un boceto de la proteína. Conociendo la secuencia de aminoácidos de las proteínas, los investigadores inician un verdadero juego de rompecabezas que puede insumir meses de trabajo: prueban con uno por uno con todos los aminoácidos, hasta descubrir su posición específica en la proteína en forma de ovillo.
Lo que es complicado en los días de actuales ya fue mucho más difícil otrora. En 1937, cuando el bioquímico austríaco Max Ferdinand Perutz empezó a usar difracción de rayos X para investigar la estructura de la hemoglobina, la proteína que transporta el oxígeno en la sangre, no había computadoras. El trabajo era todo manual: las imágenes se hacían con aparatos de rayos X mucho menos potentes, impresas en placas de vidrio y dispuestas en molduras en hilera en el laboratorio antes de calcularse en el papel la posición de los átomos. Perutz estaba determinado a revelar la forma tridimensional de la hemoglobina durante su doctorado en el prestigioso Laboratorio Cavendish, de la Universidad de Cambridge, pero no lo logró. Sólo esclareció la estructura espacial de la hemoglobina en 1959, casi dos décadas después de concluir su doctorado, hecho que le valió el Nobel de Química de 1962, compartido con el británico John Kendrew.
Siguiendo esta receta – pero con el apoyo de computadoras –, el equipo de Farah estudió 35 de los 1.700 genes de la Xanthomonas citri responsables de la fabricación de proteínas aún desconocidas y determinó la forma de dos proteínas por medio de la difracción de rayos X. Sin embargo, en el medio del camino, el bioquímico de la USP tuvo la suerte de encontrarse con Ana Paula Valente y Fábio Almeida, ambos de la Universidad Federal del Río de Janeiro (UFRJ), quienes habían desarrollado una forma de analizar proteínas por resonancia magnética nuclear sin pasar por la etapa de purificación. Farah adaptó el uso de la resonancia para analizar la estabilidad de las proteínas – cuanto más estables, es decir más plegadas sobre sí mismas, más fácilmente ellas forman cristales – y se ahorró meses de un trabajo que posiblemente llegaría a buen puerto.
Anticoagulante
Otros equipos optaron por un camino diverso. En vez de partir de conjuntos de proteínas de un microorganismo para identificar la estructura de algunas pocas, dejando de lado aquello que no salió bien, escogieron investigar la forma espacial de proteínas con las cuales ya trabajaban. Fue la decisión del biólogo Sergio Schenkman, de la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp), quien desde hace 20 años estudia proteínas del ciclo de vida del protozoario Trypanosoma cruzi, causante de la enfermedad de Chagas, y de su transmisor en América del Sur, el insecto Triatoma infestans, la vinchuca. El equipo de Schenkman detalló la estructura de dos proteínas del sistema digestivo de la vinchuca que actúan en fases distintas de la secuencia de reacciones de la coagulación de la sangre: una inhibe la acción de la trombina y la otra impide el funcionamiento del factor XIIa. Ambas tienen aplicación potencial en el tratamiento de problemas provocados por la coagulación de la sangre, como las trombosis. “Estas proteínas pueden impedir la coagulación de la sangre en el tracto digestivo del insecto, que se alimenta una vez cada 15 ó 20 días”, explica el investigador.
Por resonancia magnética nuclear, Schenkman identificó la estructura espacial de una tercera molécula, correspondiente a la porción terminal de la trialisina, una proteína de la saliva de la vinchuca que abre los poros en las células, matándolas. Es posible que el insecto inyecte esta proteína en la piel al momento de la picadura, abriéndose así camino para chupar la sangre. Los análisis del equipo de la Unifesp y del LNLS permitieron mapear regiones del tramo terminal de la trialisina importantes para la actividad de esta molécula. Con base en estas informaciones, los investigadores creen que es posible diseñar péptidos con acción antimicrobiana. A diferencia delos genomas, la cristalografía de proteínas avanza paso a paso.
El Proyecto
Structural Molecular Biology Network (Smolbnet)
Coordinador
Rogerio Meneghini – Bireme
Inversión
13.036.329,12 reales (FAPESP)
