Marcos GarutiEn el laboratorio ubicado en el 10º piso del Instituto del Corazón (InCor) de la Universidad de São Paulo, con una vista privilegiada de la capital paulista, el equipo del médico José Eduardo Krieger está comenzando a develar los orígenes de un fenómeno que limita a aproximadamente de una década la durabilidad de algunos bypass. Se trata de la obstrucción parcial del implante de segmentos de la vena safena, extraída de la pierna y empleada para restablecer el suministro de sangre en el corazón, reducido debido a la acumulación de placas de grasa en el interior de las arterias que lo irrigan. En una serie de experimentos realizados con ratones y vasos sanguíneos humanos, el grupo del InCor ha descubierto de qué manera ciertos factores físicos alteran la programación de las células de las venas sometidas a las condiciones de funcionamiento de las arterias. Esta reprogramación puede causar un espesamiento excesivo de la vena y el bloqueo del puente realizado algunos años después de la cirugía de revascularización del corazón.
Esta búsqueda ha resultado en la identificación de varias proteínas involucradas en el espesamiento de los implantes, dos de ellas caracterizadas completamente. “Creemos que con este tipo de investigación llegaremos a una o más proteínas que podrán emplearse como indicadores de la durabilidad de los bypass o como blancos para aumentar la eficiencia de los injertos”, afirma Krieger. El médico espera producir en algunos años un test genético capaz de predecir si quien se va a someter a este tipo de cirugía tiene una tendencia a desarrollar una oclusión en la vena safena, para desarrollar tratamientos destinados a mitigar el problema. “Estamos trabajando para descubrir cuándo y como intervenir”, dice.
La técnica de bypass, creada en 1967 por el médico argentino René Favaloro, revolucionó las cirugías cardíacas. En una larga operación en la cual se efectuó un corte de 30 centímetros en el pecho del paciente y se separaron las costillas, Favaloro conectó un extremo de un segmento de vena safena de casi un palmo de longitud a la arteria aorta y a otro extremo de la región del corazón privado de sangre. Así logró que la sangre esquivase el bloqueo y volviera a alimentar al músculo más fuerte y más resistente del cuerpo, que se contrae en promedio 100 mil veces por día enviando nutrientes y oxígeno a todos los tejidos del organismo. Durante estos 42 años, el procedimiento ha sido perfeccionado y se repite diariamente en todo el mundo, prolongando la vida de millones de personas -se estima que se hacen anualmente 47 mil cirugías de revascularización cardíaca en Brasil y 450 mil en Estados Unidos.
Sin embargo, esta solución no es perfecta y muchas veces se paga un alto precio por hacer que una vena, un vaso especializado en el transporte de volúmenes pequeños de sangre a baja presión, funcione como arteria, con un flujo alrededor de diez veces mayor y una presión más de 20 veces más elevada. El cambio de las condiciones en que actúa causa el espesamiento exagerado de la capa interior de células del vaso. Como consecuencia de ello, las placas de grasa que en general tardan entre cuatro y cinco décadas para comprometer el paso de la sangre en las arterias del corazón (las coronarias) se forman mucho más rápido y obstruyen alrededor de un 10% de los puentes coronarios en tan sólo diez años, lo que exige la realización de una nueva cirugía. Esta proporción de obstrucciones, que ya llegó a casi el 50% hasta comienzos de los años 1990 y disminuyó con las alteraciones en la dieta y el uso de medicamentos para bajar el colesterol, es considerada elevada aún.
“Aunque en la mayoría de los pacientes es posible emplear arterias como las mamarias para revascularizar el músculo cardíaco, la vena safena es una opción muy común pues requiere un procedimiento menos invasivo, y la safena es un vaso extenso, que permite obtener varios trozos para injertos”, explica Luís Alberto Dallan, cirujano del InCor que colabora con el equipo de Krieger. “De resolver el problema de oclusión de los puentes realizados con la vena safena, solucionaremos el principal problema de las cirugías cardiovasculares.”
Casi por casualidad, cinco años atrás, el grupo del InCor empezó a investigar el espesamiento de los bypass de vena safena. En la época, la biomédica Ayumi Miyakawa trabajaba con Krieger en la identificación de genes activados en las células de la capa interna de los vasos sanguíneos “el endotelio” por el paso de la sangre. Así como el agua de un río lame sus orillas como si quisiera arrastrarlas con la corriente, el flujo de sangre procura llevarse consigo las células que recubren internamente venas y arterias. Esa fuerza física, conocida como fuerza de arrastre, activa la maquinaria de las células del endotelio y modifica la producción de una proteína que controla el funcionamiento del vaso y la presión arterial, la enzima convertidora de angiotensina. En el Laboratorio de Genética y Cardiología Molecular, Ayumi disponía de un aparato que simulaba el arrastre, pero no se daba por satisfecha con eso. Faltaba representar una segunda fuerza a la que están sometidas las células de los vasos sanguíneos: la presión que la sangre ejerce contra la pared de venas y arterias, haciéndolas dilatar cada vez que el corazón pulsa. Ayumi le pidió al equipo de bioingeniería del InCor que le ayudasen a desarrollar un aparato capaz de reproducir ambas fuerzas tanto de modo independiente como simultáneo. Con el aparato listo, Ayumi se dio cuenta de que iba a poder probar los injertos de vena safena en condiciones análogas a las que enfrentan cuando se los implanta en el corazón.
Tan pronto como el cirujano termina la sutura y libera el paso de la sangre, el trozo de vena que pasa a llevar sangre rica en oxígeno de la arteria aorta al músculo cardíaco sufre un impacto impresionante. Formada por tres delgadas capas de células, la vena, que antes transportaba sangre rica en gas carbónico y soportaba presiones que oscilaban entre 5 y 20 milímetros de mercurio (mmHg), pasa a trabajar bajo una presión 25 veces mayor (alrededor de 120 mmHg), y eso si es que el que recibió el implante no es un hipertenso. Ya se sabía que, en las nuevas condiciones, la vena se vuelve más espesa al cabo de algún tempo. Pero no se conocían los factores físicos ni qué genes disparaban esta transformación que, de exacerbarse, puede ser dañina y perjudicar el funcionamiento del bypass.
Durante cuatro días, Ayumi cultivó segmentos de 2 centímetros de vena safena de personas operadas por Dallan bajo dos regímenes de flujo y presión -el de vena, con 5 mililitros de un compuesto rico en nutrientes y oxígeno atravesando el vaso por minuto a una presión media de 5 mmHg, y el de arteria, con un flujo de 50 mililitros por minuto y presión de 80 mmHg. Desde el primer día se detectaron transformaciones. Las células de las venas sometidas a las condiciones de arteria comenzaron a presentar señales de apoptosis (muerte programada), mientras que las de las venas mantenidas a baja presión y bajo flujo se mantuvieron vivas.
Arteria carótida de ratón tratado con proteína genéticamente alterada para penetrar más fácilmente en las células (los puntos brillantes en la imagen de al lado) y de roedor que recibió la versión normal de la misma proteína (a la izquierda)
Era un resultado interesante que despertaba aún más la curiosidad. ¿Qué sucedería con el bypass al cabo de un tiempo más extenso? ¿Los cambios observados en estas condiciones artificiales serían similares a los que ocurren en seres vivos?
Ante esa duda, Ayumi y Krieger decidieron desarrollar un experimento que reflejase mejor qué sucede con la vena safena implantada en el corazón humano. Como obviamente es muy complicado obtener muestras de esas venas después que el puente es conectado al corazón y la persona dejó el quirófano, los investigadores idearon una operación en ratones en la cual una de las arterias carótidas, que llevan la sangre del corazón a la cabeza, es conectada a una vena yugular, que drena el cerebro. Luego hicieron un seguimiento durante tres meses de las alteraciones que exhibían las yugulares mantenidas en el régimen de alto flujo y presión elevada característico de las arterias.
Entre el primer día y el tercero hubo un intenso aumento en la tasa de muerte de células de la yugular de los roedores conectada a la carótida. Sin embargo, luego de la primera semana, la situación cambió: las células muertas pasaron a ser reemplazadas por células musculares características de las capas más externas de los vasos sanguíneos. También comenzó a formarse el anillo de fibras elásticas observado únicamente en arterias, separando la primera de la segunda capa de células. “Son señales de que las venas estaban intentando adaptarse a las condiciones del nuevo ambiente”, explica Ayumi.
El problema es que en muchos casos esa adaptación sale de control y, en lugar de que la vena se robustezca, termina obstruyéndose. En el microscopio, Ayumi y Thaiz Borin notaron que la capa más interna de la yugular, en general formada por una hilera de células, se vuelve cien veces más espesa, mientras que las dos capas más externas, compuestas por células musculares contráctiles, solamente se habían duplicado.
En ese período de transformación celular, el nivel de actividad de algunos genes les llamó la atención a Krieger y a Ayumi. Uno de ellos es el que contiene la receta de la p21, una de las proteínas que inhiben la reproducción celular. Una semana después que la carótida de los roedores fuera conectada a la yugular, el nivel de la p21 en las células de la vena cayó a casi la mitad de lo normal y siguió bajo hasta el final del experimento -señal de que el gen había sido desactivado debido al cambio de ambiente.
Al mismo tiempo, el gen responsable de la producción de la proteína CRP3, en general activo solamente en las arterias, se activó enseguida después que la yugular de los roedores pasó funcionar bajo una presión elevada transportando grandes volúmenes de sangre -ese gen también apareció activo en safenas humanas sometidas a la condición de arterias. Al primer día, la CRP3, la proteína componente de la estructura que les da forma a las células, el citoesqueleto, pasó a ser elaborada en la yugular en niveles similares a los en que se encuentran en las arterias. Su producción disminuyó un poco al cabo del primer mes, pero siguió siendo elevada durante todo el experimento. Aparentemente fue el aumento de presión, y no el de la fuerza de arrastre, lo que activó la maquinaria celular y estimuló la producción de esa proteína, según informa Luciene Gastalho Campos en un artículo publicado en abril de este año en Cardiovascular Research. “Creemos que la producción de esta proteína es importante en el remodelado inicial de las venas que deben soportar el régimen hemodinámico de las arterias, porque refuerza la estructura celular”, dice Ayumi.
Otro gen que apareció activo más allá de lo normal tanto en la yugular de roedores conectada a la carótida como en las venas usadas en bypass es el de la interleuquina-1 beta, una proteína del sistema inmunológico del organismo producida en las inflamaciones. Enseguida después de la cirugía, las células de la yugular de los ratones empezaron a fabricar alrededor de 20 veces más interleuquina-1 beta que esa vena mantenida a presión baja y bajos flujos de sangre. “Este ambiente favorece el desarrollo de aterosclerosis [la acumulación de placas de grasa en las paredes de los vasos], lo que puede agravarse cuando las tasas de glucosa y colesterol en sangre son elevadas”, dice Ayumi. Durante los tres meses del estudio, los niveles de esta proteína se mantuvieron cinco veces superiores a lo normal. Ayumi midió también la tasa de interlequina-1 beta en bypass de personas que habían muerto por otras causas durante la primera semana después de la cirugía de revascularización del corazón o entre uno y cinco años más tarde. Verificó niveles más elevados de esta proteína inflamatoria, en especial durante la primera semana después de la operación.
Analizando el material genético de esos individuos, ella y Krieger descubrieron que los niveles más elevados surgieron en personas que presentaban una alteración -el intercambio de una única base nitrogenada, los ladrillos de la molécula de ADN- en la posición -511 de las dos copias del gen de la interleuquina. Quien tenía un gen normal y uno alterado fabricaba niveles intermedios, y las personas con dos copias sanas, niveles bajos de interleuquina. “Por modular el nivel de interleuquina en safenas humanas empleadas con función de arterias, estas variantes tal vez sirvan como marcador genético de la evolución de los bypass”, afirma Krieger.
Pese a estos resultados prometedores, serán necesarios todavía años de trabajo hasta que se obtenga un test genético capaz de indicar la durabilidad de un bypass. Mientras avanzan los experimentos destinados a verificar la factibilidad del test, el equipo del InCor piensa en formas de controlar el funcionamiento de los genes y prolongar los beneficios de la cirugía que se vale de la vena safena para hacerle desempeñar la función de las coronarias enfermas, un problema que mata a 7,2 millones de personas por año en el mundo.
Ellos ya han demostrado que al menos una de éstas funciona. Usando bacterias, el equipo de Krieger logró fabricar una versión recombinante de la p27, una proteína de la familia de la p21 también capaz de detener la reproducción celular. En un experimento llevado a cabo en colaboración con los equipos de Ana Maria de Oliveira y Leandra Ramalho, de la USP de Ribeirão Preto, el grupo del InCor implantó alrededor de la carótida de ratones un anillo de silicona que liberaba lentamente la proteína alterada para penetrar más fácilmente en las células. Dos semanas después de la cirugía, la multiplicación celular fue menor en la arteria de los animales tratados con p27 recombinante que en la de aquéllos que recibieron una proteína inocua, de acuerdo con los datos publicado en un artículo de Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease. “Es una estrategia de intervención que se ha mostrado capaz de controlar la reproducción celular solamente en la región en que debía ser bloqueada”, comenta Krieger. El equipo del InCor planea ahora usar proteínas asociadas a stents, una especie de muelle implantado en el interior del vaso sanguíneo para mantenerlo abierto, o globos como los usados en cateterismos para, de ser necesario, estimular o inhibir la reproducción celular y aumentar la durabilidad de los bypass.
Los proyectos
1. Identificación de genes con expresión diferenciada en vena safena sometida al régimen arterial (00/09485-7); Modalidad Beca de posdoctorado; Becária Ayumi Miyakawa; Coordinador José Eduardo Krieger – InCor; Inversión R$ 195.776,52 (FAPESP)
2. Genes expresados diferentemente en modelo de arterialización de injerto venoso en ratón (03/01828-0); Modalidad Beca de doctorado; Becária Thaiz Ferraz Borin; Coordinador José Eduardo Krieger – InCor; Inversión R$ 98.222,52 (FAPESP)
3. Estudio de la hipertensión arterial: caracterización molecular y funcional do sistema cardiovascular (01/00009-0); Modalidad Proyecto temático; Coordinador: José Eduardo Krieger – InCor; Inversión R$ 6.111.202,31 (FAPESP)
4. Identificación y caracterización de genes ligados a la arterialización del injerto venoso humano; Modalidad Ayuda a la investigación; Coordinador Eduardo Moacyr Krieger – InCor; Inversión R$ 50.000, 00 (CNPq)
Artículos científicos
CAMPOS, L.C. et al. Induction of CRP3/MLP expression during vein arterialization is dependent on stretch rather than shear stress. Cardiovascular Research. Abr. 2009.
NEUKAMM, B. et al. Local TAT-p27Kip1 fusion protein inhibits cell proliferation in rat carotid arteries. Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease. v. 2, p. 129-136. Jun. 2008.
BORIN, T. F. et al. Apoptosis, cell proliferation and modulation of cyclin-dependent kinase inhibitor p21cip1 in vascular remodelling during vein arterialization in the rat. International Journal of Experimental Pathology. v. 90, p. 328-337. Jun. 2009.
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