eduardo cesarEn busca de microorganismos más eficientes para la producción de etanol, dos grupos de investigadores brasileños desarrollaron, mediante distintos métodos, dos nuevas cepas de levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, capaces de producir mayores cantidades de la sustancia. Las levaduras, que son pequeños hongos microscópicos, ejercen un rol fundamental en la transformación de azúcar en alcohol durante el proceso de fermentación en las centrales. El grupo liderado por el profesor Boris Ugarte Stambuk, de la Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC), recurrió a la ingeniería genómica, mientras que los investigadores coordinados por la profesora Cecília Laluce, de la Universidad Estadual Paulista (Unesp) de Araraquara, en el interior paulista, utilizaron la genética clásica para la obtención de un híbrido con base en las levaduras seleccionadas. Realizamos una intervención en el genoma de la especie Saccharomyces para modificar la forma en que actúa en el fermentador y así conseguimos optimizar el proceso, dice Stambuk, del departamento de Bioquímica en el Centro de Ciencias biológicas de la UFSC, quien también coordina un grupo de investigación en esa institución, creado en 1997, para estudiar la biología molecular y la biotecnología de levaduras. Con la misma cantidad de sacarosa logramos obtener entre un 10% y un 15% más de etanol.
La estrategia consistió en modificar la forma en que la Saccharomyces produce la enzima invertasa, encargada de acelerar el proceso de la hidrólisis (disociación) de los carbohidratos de la sacarosa, transformándolos en glucosa y fructosa. Esa reacción, que sucede fuera de la célula de levadura, se denomina hidrólisis extracelular. Con la alteración de la invertasa mediante la modificación del gen específico para esa enzima, el azúcar pasó a ser transportado y fermentado directamente en el interior de la Saccharomyces. La hidrólisis extracelular es un sistema que considero ineficiente ya que favorece el desarrollo de otras levaduras y bacterias presentes en las dornas de fermentación, que consumen glucosa y fructosa, dice Stambuk, quien también es supervisor acreditado en el Programa de Posgrado en Biotecnología de la Universidad de São Paulo (USP). Cuando fermentan, estos microorganismos contaminantes del proceso producen ácidos orgánicos que originan pérdidas en la producción de etanol.
La próxima etapa de la investigación, que contó con la participación de investigadores del Instituto de Química y de la Escuela Superior de Agricultura Luiz de Queiroz de Piracicaba, ambos dependientes de la USP, consistirá en probar la levadura genéticamente modificada en Usina Cerradinho, de la localidad de Cantaduva, interior paulista, para evaluar cómo se comporta en un ambiente industrial. Este estudio contó con el apoyo financiero de la FAPESP, por medio de un Proyecto Temático coordinado por el profesor Pedro Soares de Araújo, del Instituto de Química de la USP, y del Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), que aprobó una propuesta presentada por Stambuk en colaboración con Fermentec, empresa de consultoría especializada en fermentación alcohólica, en un concurso de Desarrollo Tecnológico e Innovación.
Eduardo CesarStambuk comentar que su interés por una vía de captación directa del azúcar por parte de la levadura comenzó en 1997. Algunos estudios que apuntaban esa posibilidad ya habían sido realizados en la década de 1980 por investigadores españoles y australianos, pero no prosperaron. Antes de la realización del proyecto que resultó en la levadura genéticamente modificada, el investigador había sido director de tesina de dos alumnos de maestría que caracterizaron al gen responsable de la captación directa del azúcar. En la literatura específica ya se había descrito que eso fuera posible con la fermentación de la maltosa, otro azúcar que la Saccharomyces fermenta eficientemente, expresa Stambuk. La levadura empuja a la maltosa hacia el interior de la célula y fermenta el azúcar en su interior.
Desde el comienzo del proyecto con la levadura genéticamente modificada en 2005, se ensayaron varias estrategias destinados a que dejase de producir la invertasa extracelular y pasase a transportar el azúcar hacia el interior de la célula, donde se realiza la hidrólisis de la sacarosa. Una de ellas fue muy exitosa y redundó en un depósito de patente en abril de este año, en colaboración con Fermentec. Varias tesinas de maestría y tesis de doctorado en curso, que tienen a Stambuk como director, y fueran presentadas en la UFSC y USP, también son fruto de este proyecto. La profesora Ana Clara Guerrini Schenberg, del Instituto de Ciencias Biomédicas de la USP, quien desde la década de 1970 investiga con levaduras, resaltó que la estrategia desarrollada resulta innovadora. Representa una nueva forma en que la levadura produce alcohol, dijo Ana Clara, quien fue parte de la mesa examinadora de uno de los alumnos de Stambuk.
El investigador, que cuenta con varios proyectos en el área, incluso en el secuenciamiento del genoma de levaduras industriales, explica que las modificaciones genéticas se tornan estables dentro de la levadura porque fueron realizadas en los propios cromosomas. Muchas modificaciones se realizan con plasmodios para levaduras, material genético que se encuentra también en bacterias, pero en el mundo industrial eso no funciona, ya que esas moléculas son inestables.
Resistencia al calor
La otra cepa de levadura que también demostró en pruebas de laboratorio que es una excelente productora de alcohol, presenta otra característica que la torna especial para las condiciones enfrentadas en los procesos industriales. Es resistente a las altas temperaturas. Mientras las levaduras comerciales para la producción de etanol fermentan bien entre los 30ºC y 34ºC, la levadura que desarrollamos fermenta entre 37ºC y 38ºC con escasa mortalidad celular, dice Cecília. Al ser muy difícil controlar la temperatura en el proceso de fermentación durante el verano, cuando ocurre una elevación por encima de los 36ºC, inmediatamente aumenta la toxicidad del alcohol en las dornas, provocando la muerte de las levaduras productoras de etanol.
Instituto de Química/UNESP AraraquaraOtra innovación que aporta esta nueva cepa, que fue patentada por la Agencia Unesp de Innovación en septiembre de 2008, es que fermenta rápidamente. Realiza la conversión total del azúcar en hasta tres horas, mientras que por el proceso tradicional la fermentación tarda entre 6 y 12 horas, dice la investigadora, quien desde la década de 1990 se dedica al estudio de fermentos. Esto representa una ventaja porque, cuanto más largo es el tiempo de fermentación, mayores son los efectos de los microorganismos contaminantes y de otros factores agresivos, tales como la temperatura elevada y la deficiencia nutricional del proceso sobre el fermento. La nueva cepa también resiste a porcentajes elevados de etanol y a la acidez en ciclos sucesivos de fermentación.
Para obtener esta levadura, se seleccionaron varios linajes de Saccharomyces cerevisiae halladas en usinas que presentaban características tales como tolerancia al calor y el rápido consumo de azúcar para la producción de etanol. Luego de varios ensayos y combinaciones, se obtuvo una levadura híbrida, que recibió marcadores genéticos que permiten su monitoreo durante todo el proceso de fermentación alcohólica. mediante los marcadores es posible conocer la proporción de esa levadura en relación con los microorganismos contaminantes presentes en las dornas de fermentación, dice Cecília. Asimismo, permite observar si las células del fermento pasan por alteraciones durante la zafra, si la levadura es dominada por levaduras salvajes y también si desaparece del proceso, vencida por las competidoras. Actualmente esa diferenciación se realiza solamente mediante técnicas de biología molecular que requieren el trabajo de consultores especializados.
En la central, la misma levadura se utiliza en varios ciclos de fermentación durante la zafra entera, que dura hasta siete meses, expresa la investigadora Karen de Oliveira, quien trabajó con la levadura híbrida durante su doctorado, dirigido por Cecília y culminado en 2008. En algunos casos, se utilizan tres especies diferentes de Saccharomyces al inicio de la zafra en centrales, y al cabo de un mes ya no existe ninguna, informa. Las levaduras que se hallan en el ambiente o en la propia materia prima invaden el proceso de producción de etanol y comienzan a multiplicarse. Aunque las levaduras presentes en el ambiente solamente necesitan alimentarse, no producir alcohol, dice Karen, quien en la actualidad investiga el comportamiento de levaduras durante la fermentación de hidrolizados del bagazo de la caña en su postdoctorado. El proyecto, coordinado por la profesora Cecília Laluce y que cuenta también con la participación de los investigadores Sandra Sponchiado y Eduardo Cilli, forma parte del Programa FAPESP de Investigación en Bioenergía (Bioen).
Controlar la estabilidad de las levaduras durante el transcurso de la zafra resulta esencial para garantizar la continuidad de los ciclos sucesivos de fermentación, dice Cecília. Eso sucede porque, cuando el fermento comienza a quedar intoxicado por el exceso de alcohol producido o por la ocurrencia de las condiciones de estrés de la fermentación, muere, lo cual puede conducir al reinicio de todo el proceso. El colapso de un proceso, con detención completa y reinicio, significa graves perjuicios para las centrales, resalta. La próxima etapa del proyecto, que ya está siendo negociada con el Centro de Tecnología Canavieira (CTC), consiste en probar la levadura híbrida mediante un proceso industrial.
Mutación inducida
La levadura Saccharomyces cerevisiae cuenta con mecanismos para soportar el estrés, tal como revelan estudios realizados en laboratorio por la profesora Sandra Regina Ceccato Antonini, del Centro de Ciencias Agrarias de la Universidad Federal de São Carlos (UFSCar), en el campus de Araras. Algunos factores, tales como la deficiencia de nutrientes y la presencia de algunos tipos de alcoholes producidos junto con el etanol durante la fermentación, conducen a un cambio en su morfología de unicelular, ella pasa a filamentosa, o sea, formada por una cadena de células, muchas de éstas extremadamente alargadas y deformadas, que puede compensar la pérdida de eficiencia productiva provocada por el estrés. Para la levadura significa una manera de escapar de un ambiente desfavorable, dice Sandra.
La investigadora ha estudiado este efecto en el proceso de fermentación alcohólica, porque dentro de las dornas de fermentación la levadura vive bajo un estrés muy grande. Aunque los datos todavía no son concluyentes, la investigadora resalta que aquella transformación indica una ventaja adaptativa para la levadura, ya que aumenta su área superficial.
La levadura pasa de ser una célula a un largo filamento, dice Sandra, quien desarrolló la investigación con apoyo de la FAPESP, mediante un apoyo regular, comenzando en 2005 y finalizando en 2008. Como el área celular aumenta, puede darse un mayor contacto con el medio de cultivo, conduciendo a una compensación por la muerte de las células ocasionada por el estrés.
En las situaciones en que la levadura se halla estresada y no evoluciona hacia la forma filamentosa, el perjuicio del estrés puede ser mayor, dice ella, subrayando que, incluso bajo condiciones estresantes, algunos linajes de Saccharomyces no cambian su morfología. La explicación para ello es que ese cambio puede constituir una característica genética, pero todavía no se conoce un gen específico relacionado con esa transformación. Existen varios genes que pueden estar implicados en este proceso.
En opinión de la investigadora, el hecho de que esa característica se halle presente en levaduras industriales significa que alguna función debe tener, ya que aparece debido a una presión selectiva. Al principio creí que se trataba de una característica perniciosa, pero después empecé a percatarme de su importancia.
Los proyectos
1. Estrés, transporte y metabolismo de alfa-glucósidos en Saccharomyces cerevisiae (nº 04/10067-6); Modalidad Proyecto Temático; Coordinador Pedro Soares de Araújo – USP; Inversión R$ 482.204,54 (FAPESP)
2. Optimización de la fermentación de la sacarosa y producción de alcohol con Saccharomyces cerevisiae; Modalidad Desarrollo Tecnológico e Innovación; Coordinador Boris Ugarte Stambuk-UFSC;
Inversión R$ 173.005,92 (CNPq)
3. Aspectos básicos y aplicados en la utilización industrial de levaduras (nº 05/01498-6); Modalidad Apoyo Regular al Proyecto de Investigación; Coordinadora Cecília Laluce – Unesp; Inversión R$ 118.245,46 (FAPESP)
Artículos científicos
BATISTA, A.S. et al. Sucrose fermentation by Saccharomyces cerevisiae lacking hexose transport. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. v. 8, p. 26-33. 2004.
BADOTTI, F. et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. v. 7. 2008.
