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Genética

La construcción de un descubrimiento

Un linaje brasileño de células madre embrionarias humanas abre el camino para nuevas investigaciones en busca de tratamientos contra enfermedades

Una colonia viva: las células madre embrionarias se multiplican en una placa con medio artificial

Laboratorio de Ligya da Veiga Pereira/ USP Una colonia viva: las células madre embrionarias se multiplican en una placa con medio artificialLaboratorio de Ligya da Veiga Pereira/ USP

Las células madre extraídas de embriones humanos han sido celebradas como la gran esperanza para curar muchas enfermedades contra las cuales la medicina actual tiene hasta cierto punto las manos atadas. Tal es el caso de determinados problemas cardíacos, de anomalías de origen genético como la distrofia muscular y de enfermedades degenerativas del sistema nervioso como el mal de Parkinson. Frecuentadoras asiduas de las páginas de ciencia y salud de diarios y revistas, dichas células, que pueden dar origen a cualquier tejido humano, cobraron aún más relieve a partir del día 2 de octubre, cuando la genetista Lygia da Veiga Pereira, de la Universidad de São Paulo (USP), anunció que había obtenido un linaje brasileño de células madre embrionarias el BR-1.

Esta novedad fue recibida con fiesta por sus colegas presentes en el III Simposio Internacional de Terapia Celular realizado en la ciudad de Curitiba, Paraná. Luego de la presentación, algunos investigadores plantearon sugerencias, tales como la de chequear la capacidad de las células. “Pero lo que querían realmente era saber cuándo estarían disponibles las células”, comenta Lygia. Incluso quienes no entraron en esa lista de espera afirman que el logro es importante y otorga independencia a los investigadores brasileños. Más que sustituir la importación de este tipo de célula, la genetista de la USP celebra la competencia técnica que su grupo demostró al obtener y mantener el linaje. Ella empezó a trabajar con células madre embrionarias importadas enseguida después de la aprobación de la Ley de Bioseguridad en 2005, que reglamentó este tipo de investigación. En 2006 trajo a investigadores extranjeros como Prithi Rajan, del Instituto Burnham de San Diego, Estados Unidos, para que demostrara cómo hacer el cultivo de las células. “Ella nos enseñó las condiciones ideales de cultivo y demostró como había que entrenar el ojo para ver cuando las células están ‘felizes'”, recuerda. Así y todo, los primeros linajes murieron. “Tuvimos que alterar detalles en el medio de cultivo y así demostramos que conseguimos hacerlo solos”. El cardiólogo José Eduardo Krieger, del Instituto del Corazón (InCor) de la USP, le hace coro: “Lo más importante es dominar la tecnología. Sólo así podemos interferir activamente en todo el proceso de investigación con terapia celular.  Y eso no tiene precio”. El presidente de la Federación de Sociedades de Biología Experimental (Fesbe), Luiz Eugênio Mello, agrega: “En muchos linajes norteamericanos es difícil saber si las células están en buenas condiciones de mantenimiento. Es diferente cuando existe un vecino que puede informar 100% sobre las características del material con el que uno trabaja”.

Otra ventaja es la agilidad para lograr muestras de células. Para la genetista Mayana Zatz, del Centro de Estudios del Genoma Humano de la USP, el gran obstáculo para hacer investigación con células madre en Brasil es el tiempo que insume importar todo el material. “Tardamos meses para recibir reactivos, cosa que un estadounidense tiene en sus manos en menos de 48 horas”, comenta. “En un área competitiva como ésta, se hace prácticamente imposible publicar en periódicos internacionales.”

Pese a ser celebrada, la inversión necesaria para desarrollar un linaje de células madre embrionarias está sujeta a críticas por ser más bien un avance técnico que científico. Lygia es la primera en admitirlo: “No hay innovación científica en este resultado, es un trabajo sin gloria que alguien debía hacer”. La obtención de células madre consiste en extraer unas 50 células de un embrión de cinco días, cuando éste todavía es una masa de tan sólo 150 células, y hacer que se mantengan vivas y dividiéndose, pero sin transformarse en células de tejidos específicos, como la piel, los músculos o el sistema nervioso. Esta capacidad de originar tantas variedades de células “la pluripotencia” hace de las células madre embrionarias un comodín del organismo.

No se requieren instalaciones muy especiales para trabajar con dichas células: Lygia armó su Laboratorio de Genética Molecular con apoyo de la FAPESP para proyectos anteriores. Además del equipamiento básico, reactivos y microscopios, basta con tener un área aislada para trabajar con las células y una incubadora para mantenerlas a una temperatura cómoda, de 37 grados Celsius. Parece sencillo, pero pocos laboratorios en Brasil tienen la receta para mantener las células en esas condiciones. Pero aun así el logro del grupo de Lygia no es novedad, pues ya existen linajes de células madre en varios países — el pionero fue el norteamericano James Thomson, de la Universidad de Wisconsin, en 1998.

Embrión de cinco días del cual se extraen las células pluripotentes

Laboratorio de Ligya da Veiga Pereira/ USP Embrión de cinco días del cual se extraen las células pluripotentesLaboratorio de Ligya da Veiga Pereira/ USP

Transferencia de conocimiento
Obtener un linaje de células madre embrionarias es ante todo una prueba de paciencia y mucha persistencia para encontrar la composición precisa del líquido que nutre las células. Lygia cuenta para ello con un equipo de estudiantes — algunos becarios de la FAPESP, aunque el proyecto específico que desembocó en la BR-1 haya sido financiado por el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) y por el Ministerio de Salud. Para obligar a las células a seguir siendo pluripotentes, el procedimiento tradicional era cultivarlas sobre una capa de fibroblastos de ratón. Estas células secretan una combinación de sustancias que mantienen el cultivo en ese estado versátil, pero los investigadores se preocupan porque también producen compuestos típicos de roedores que pueden de alguna manera contaminar a las células humanas, que quedarían ineptas para fines terapéuticos. Lygia procuró usar fibroblastos humanos, pero no tuvo éxito. Finalmente, el año pasado, echó mano de una nueva herramienta: un medio de cultivo artificial que tiene todo lo que la célula necesita: aminoácidos, vitaminas y factores de crecimiento. Con algunos ajustes más salió bien y de allí salió la BR-1.

Lygia se preocupó en optimizar todo el proceso antes de usar los minúsculos embriones que, como la ley brasileña exige, estaban hacía más de tres años en los congeladores de las clínicas de reproducción asistida Fertility, en São Paulo, y Prof. Franco Junior, en Ribeirão Preto. Pero con la técnica dominada, la tasa de éxito es baja: de los 250 embriones descongelados inicialmente, la mayor parte ya no  era viable y no podría usarse con fines reproductivos. Sólo 35 se desarrollaron hasta el estadio de 150 células. Solamente las células de uno de esos embriones lograron echar raíces en el medio de cultivo y comenzaron a propagarse como césped en suelo fértil.

El producto de dos años de trabajo se encuentra ahora en decenas de ampollas almacenadas en el congelador del Laboratorio de Genética Molecular de la USP. Y también en la incubadora y en los bancos del laboratorio, donde el equipo prueba las células para verificar si son efectivamente pluripotentes. Hasta ahora parece que sí. El equipo de Lygia demostró que la morfología de las células que se reproducen en las placas de vidrio es típica de las células madre. El grupo también las analizó genéticamente y detectó la actividad de genes que solamente se expresan en células pluripotentes. La gran prueba consistió en remover los frenos que mantienen las células en estadio no diferenciado. “Las células entran en diferenciación caótica”, explica la investigadora de la USP, que vio surgir neuronas y células de músculos, reconocidas por sus características al microscopio y también por anticuerpos específicos. Faltan todavía ensayos importantes para garantizar que las células tendrán la versatilidad funcional que se espera de ellas: el primero consistirá en implantar algunas de dichas células en ratones y ver si causan teratomas, estructuras donde las células se multiplican y se diferencian en diferentes tejidos. “Forma una masa con piel, músculos, cabellos, dientes, de lo más variada”, comenta Lygia. También será necesario hacer pruebas funcionales para saber si por ejemplo las células con apariencia de neuronas realmente producen potenciales de acción en respuesta a un estímulo eléctrico, como lo hacen en un organismo.

Lygia y sus colaboradores pretenden producir células suficientes para todos los grupos brasileños interesados en hacer investigación con células madre. Para ello será necesario producir células en amplia escala, tarea a la cual se aboca el neurocientífico Stevens Rehen en su laboratorio de la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ).

La cantidad de células no debe ser problema. En sociedad con Leda Castilho y los alumnos de doctorado Aline Marie Fernandes y Paulo André Marinho, todos de la UFRJ, Rehen desarrolló una técnica que permite obtener 90 millones de células en dos semanas, 70 veces más que lo que sería posible en el cultivo tradicional, con una serie de ventajas sumadas a la eficiencia. “Debemos cambiar menos veces el medio de cultivo, cosa que reduce el riesgo de contaminación; así, el proceso resulta tres veces más barato”, dice el investigador de Río, quien para multiplicar células en cultivo adaptó un ingenioso método empleado para la producción de fármacos. En lugar de cultivarlas en las placas que parecen hormas de hielo — si se las llenase de agua, producirían seis cilindros de hielo de alrededor de 3,5 centímetros de diámetro —, transfiere células a un biorreactor. Pese al nombre pomposo, Rehen describe el biorreactor como un enorme frasco de mayonesa con una placa y una eje magnetizados que agitan el vidrio y controlan totalmente su contenido. Asimismo, en lugar de dejar que las células proliferen sujetas al fondo de la placa, éste agrega microesferas a la mezcla. Al cabo de un tiempo de descanso, las células se adhieren a las esferas ?entonces es hora de empezar a agitar. Con las esferas en suspensión, aumenta mucho el área que las células tienen para ocupar. Asimismo, la agitación deja el ambiente más oxigenado y propicio para reacciones biológicas.

La productividad anticipada por Rehen contemplaría con creces la demanda brasileña, incluso con el desperdicio que habría al comienzo, hasta que los grupos de investigación aprendan a mantener las células embrionarias humanas en medio de cultivo — con ayuda de Lygia y Rehen, que se disponen a capacitar a aquéllos que tengan interés en trabajar con ellas. Pero aún es prematuro para cantar victoria. El neurocientífico carioca se muestra optimista; al fin y al cabo, su método tuvo éxito con las células norteamericanas. De cualquier modo, será necesario ver si las células BR-1 mantienen su capacidad pluripotente después de multiplicarse en gran escala.

celula tronco abreLaboratorio de Ligya da Veiga Pereira/ USPUn instrumento de investigación
Lygia pretende ampliar la familia de las BR. “No está claro cuán idénticos son los linajes entre sí”, cuenta, “verificamos que cada uno de ellos es más propenso a diferenciarse en un tipo de tejido u otro”. Asimismo, particularidades genéticas pueden ser necesarias para cada línea de investigación. La propia Lygia, por ejemplo, está interesada en entender de qué manera los dos cromosomas X, que juntos definen que un ser humano será mujer, interactúan en una célula. Eso es importante, pues en cada célula de una mujer existe un mecanismo que inactiva uno de los cromosomas X — de otro modo, los genes ubicados en ese cromosoma tendrían una presencia duplicada en las mujeres en relación con los hombres. Para entender de qué modo esto funciona, Lygia necesita células femeninas, que no es el caso de la BR-1, obtenida a partir de un embrión masculino. A medida que se multiplican, las células acumulan pequeños cambios. Por eso los linajes antiguos son más diferentes con relación al embrión original que uno establecido más recientemente. La comparación de las propiedades de linajes diferentes será precisamente la misión del doctorado de Ana Maria Fraga, la alumna de Lygia que tuvo un papel central en el establecimiento del linaje brasileño.

Pese al interés que las noticias sobre células madre suscitan en el público, los tratamientos con este tipo de células todavía tardarán para llegar a la realidad — los investigadores ni siquiera se arriesgan a dar una previsión. Mayana Zatz no se cansa de repetir que las células en sí mismas no constituyen un tratamiento: “No vamos a inyectar células madre embrionarias en nadie”. Hasta ahora, los experimentos han demostrado que las células madre indiferenciadas generan tumores cuando se las inyecta en animales. Los investigadores las ven como un poderoso instrumento de investigación, no como una solución terapéutica mágica. Cuando entiendan de qué manera las células madre embrionarias originan todos los tejidos humanos, podrán intentar interferir en la actividad de los genes y en las características del ambiente, lo que les permitirá manipular células adultas. “Las células embrionarias son las únicas que tienen el hardware completo”, explica Krieger, del InCor, “debemos conocer el software y aprender a explorar ese software en otras células”. En ese punto, es posible que las células madre embrionarias lleguen incluso a dejar de ser necesarias.

Con ese espíritu, el cardiólogo procura descubrir cuáles son los estímulos químicos que transforman a las células madre embrionarias en diferentes componentes del sistema vascular como el músculo cardíaco o los vasos sanguíneos. Las líneas de investigación que prometen resultados más rápidos son las que usan células madre adultas. En su laboratorio, Krieger tiene ensayos clínicos en marcha para averiguar la capacidad de células de la médula ósea del propio paciente para corregir isquemias, cuando el corazón recibe menos sangre que la que necesita. Si todo sale bien, será posible reemplazar, o al menos complementar la gran cantidad de cirugías de puentes, o by pass, que es cuando se implanta un nuevo vaso sanguíneo para reemplazar uno obstruido y restituir el flujo de sangre hacia el corazón.

Anticuerpos marcan células pluripotentes (las dos de arriba) y transformadas en neuronas (los núcleos en azul)

Laboratorio de Ligya da Veiga Pereira/ USPAnticuerpos marcan células pluripotentes (las dos de arriba) y transformadas en neuronas (los núcleos en azul)Laboratorio de Ligya da Veiga Pereira/ USP

Paso a paso
El entusiasmo mayor de Krieger se refiere a un proyecto que no tiene que ver con las células madre — ni embrionarias ni adultas — y por eso mismo demuestra que tal vez sea posible prescindir de células embrionarias una vez develado su funcionamiento. Se trata de la manipulación de células de la piel o de fibroblastos para que produzcan una sustancia llamada factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). Inyectadas en el sistema vascular, dichas células llevan un recado a las células del sistema circulatorio al lugar donde está la deficiencia: produzcan más células. En lugar de implantar células madre que se transformarán en tejido cardíaco o vascular, la estrategia es estimular la producción local. El trabajo formó parte del doctorado de Giovana Gonçalves, que defendió su tesis este año. “Es una idea tan sencilla que a la gente le cuesta aceptarla”, se divierte el orientador. Por ahora los resultados fueron tan buenos que el grupo de Krieger comienza a hacer pruebas en cerdos, cuyo corazón es mucho más parecido al de los seres humanos que el de los ratones. Y tiene el privilegio de estar en el InCor, con acceso a aparatos de primera línea — los mismos usados con pacientes humanos — para monitorear el corazón de los cerdos.

Las células madre adultas constituyen también la materia prima de las genetistas Maria Rita Passos-Bueno y Daniela Bueno, de la USP, que extraen células de músculo y de la pulpa de los dientes para regenerar huesos. Su objetivo, sobre el cual se publicaron resultados prometedores recientemente en el sitio de la revista Tissue Engineering, es reparar defectos craneanos congénitos, tales como el labio leporino y la fisura palatina. “Las células madre embrionarias son importantes, pero debemos recordar que las células que naturalmente reconstituyen el tejido cuando está dañado son las adultas”, afirma Maria Rita.

Stevens Rehen, a su vez, pretende entender de qué modo las neuronas se diferencian y cómo surgen alteraciones en el número de cromosomas. Cuando — y si — logra llegar a la receta de producir un tipo específico de neuronas, los dopaminérgicos, tendrá una buena arma contra el mal de Parkinson, una enfermedad que su grupo estudia en un modelo en ratones. En el marco del simposio de terapia celular de Curitiba, el mismo donde Lygia presentó la BR-1 a la comunidad, Rehen mostró resultados de una segunda línea de investigación, llevada adelante en colaboración con el laboratorio de Ana Maria Martinez, de la UFRJ. El grupo provocó lesiones en la  médula de ratones, similares a las que pueden causar parálisis después de un accidente automovilístico. La compresión mata tanto a las células neuronales como a las que forman a vaina de mielina alrededor de las neuronas. Se implantaron células madre embrionarias de antemano orientadas hacia el camino neural, cuando todavía tienen flexibilidad para convertirse en neuronas u otro tipo de células del sistema nervioso, pero nunca de otro tipo, como epiteliales o musculares. Los resultados fueron buenos: al cabo de dos meses, los ratones recuperaron alrededor del 60% de la movilidad. Si les hubieran inyectado células indiferenciadas, en ese mismo tiempo las mismas habrían dado origen a tumores — de allí la necesidad de orientarlas antes. “Sería como poner a un niño de 8 años en la facultad”, compara el neurocientífico. “Es mejor dejar al niño estudiar, aprender y ponerlo en la facultad más adelante.”

Rehen está usando células madre de ratones, como así también células humanas importadas de Estados Unidos. “En este punto de nuestra investigación no estoy limitado por la falta de un linaje brasileño”, comenta. El problema surgiría cuando llegase al punto de producir tratamientos con base en esas células: los acuerdos obligarían a los investigadores brasileños a dividir los réditos con Estados Unidos. “Con la BR-1,  las patentes serán 100% brasileñas.”

Mayana Zatz hace hincapié en que lo que más falta en Brasil es estructura para la investigación. “En el exterior, las universidades tienen lo que ellos denominan core facilities, que son centros que producen los productos necesarios, tales como células madre, transgénicos o reactivos”, comenta. “Acá, cada laboratorio debe saber hacer todo por cuenta propia”. De cualquier modo, su grupo ha logrado proyección internacional con investigaciones sobre células madre para regenerar músculos y huesos: junto a Maria Rita Passos-Bueno, han sido nueve trabajos publicados en revistas internacionales desde el año pasado. Pese a ser defensora de las investigaciones con células madre embrionarias, Mayana se ha concentrado más en células madre adultas, con las cuales espera obtener resultados más inmediatos. “Me pone contenta que Lygia tenga ganas de trabajar con las embrionarias y ayudar a otros investigadores a saltar etapas. Valió la pena luchar por la autorización de las investigaciones”, completa. Para ella, aun cuando todo salga bien con la BR-1, el linaje es aún el comienzo de un largo camino. “Tenemos ladrillos brasileños, ahora debemos construir la casa desde cero.”

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