Alexandre TelesCuatro grupos de científicos paulistas se dedican a mapear y relacionar la función de marcadores moleculares tales como lípidos, proteínas y carbohidratos con la ayuda de técnicas de análisis no invasivas, valiéndose de láser y espectrómetros para seleccionar en la fertilización in vitro (en laboratorio) los mejores embriones bovinos. El objetivo consiste garantizar el éxito de la gestación al implantarlos en el útero de las vacas. Aunque Brasil ostenta actualmente el primer puesto en la producción mundial in vitro ‒con 366.517 embriones bovinos producidos en 2013, correspondientes al 70% del total‒, hay mucho por mejorar, porque las pérdidas se ubican entre el 20% y el 60%. La variabilidad de esos índices radica, entre otros factores, en la calidad del embrión y en la receptividad del endometrio, la membrana que reviste al útero.
El avance en técnicas rápidas, menos invasivas, y un costo factible en el análisis y selección de embriones, podría ser de ayuda en el futuro, en los procedimientos biotecnológicos de la reproducción, tanto en animales como en humanos. Un método innovador, que conjuga la producción de imágenes con el mapeo químico de marcadores moleculares presentes en óvulos y embriones mediante la técnica de espectrometría de masas, que desarrollaron en conjunto, investigadores de la Universidad de Campinas (Unicamp) y de la Universidad de São Paulo (USP), podría representar un avance significativo en las biotecnologías de la reproducción. “Con el uso de esta herramienta analítica es posible visualizar partes específicas del embrión bovino, como es el caso de la zona pelúcida, que recubre a todo el embrión y es la responsable de su conexión con el útero”, explica el profesor Rodrigo Catharino, coordinador de las investigaciones y del Laboratorio Innovare de Biomarcadores, vinculado a la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Unicamp. La presencia de biomarcadores tales como los lípidos, que funcionan como indicadores de procesos biológicos, puede mejorar esa conexión, dando como resultado preñeces con mayores posibilidades de éxito. En la fertilización in vitro, los óvulos extraídos de una vaca donante maduran y son fecundados en laboratorio. Luego de la fecundación, los posibles cigotos ‒células diploides formadas por la fusión del óvulo con el espermatozoide‒ se mantienen en incubadora para su desarrollo durante siete días, cuando se los congela, o bien se los implanta en una vaca receptora.
In Vitro BrasilEmbriones bovinos listos para transferirlos a las receptorasIn Vitro Brasil
Las investigaciones originaron dos artículos científicos. En el primero de ellos, que se publicó en la revista Analytica Chimica Acta, los autores describen el uso de la espectrometría de masas en la modalidad Maldi para visualizar las diversas zonas que componen el embrión bovino. En esa modalidad, una matriz ‒generalmente un ácido orgánico capaz de absorber la luz‒ se aplica sobre la muestra y, a continuación, se realizan disparos de haces de luz láser, que provocan la formación de iones (átomos con pérdida de electrones). Las moléculas ionizadas penetran en un tubo sometido al vacío (analizador) y son transportadas hasta un detector. Los iones de menor tamaño atraviesan el tubo más rápidamente que los mayores. De tal manera, las sustancias de las muestras forman espectros, cada uno con una masa diferente.
“La unión de los puntos y la información de cuál molécula forma parte del espectro de masas, permiten conocer cuál biomarcador se impone en cada sitio de la muestra”, dice Catharino. “Logramos observar las estructuras por separado, y no solamente el cuerpo del embrión y el del ovocito [la célula sexual que se produce en los ovarios de los animales], tal como se observa en las técnicas clásicas de análisis”. El investigador subraya que la posibilidad de conocer la ubicación exacta de un marcador químico configura una innovación. “Muchos de los marcadores descritos en los trabajos son inéditos, lo cual significa que todavía hace falta investigar bastante para descubrir lo que ellos representan en el proceso de producción de embriones in vitro”.
Laboratorio de biología de la reproducción animal/ UFABC Embriones bovinos en fase de blastocistoLaboratorio de biología de la reproducción animal/ UFABC
El segundo artículo, publicado en la revista Reproduction, Fertility and Development, describe el uso del espectrómetro Maldi para investigar la evolución de lípidos biomarcadores en óvulos bovinos y en embriones de hasta ocho células y blastocitos ‒estructuras esféricas que se forman en una etapa más avanzada del desarrollo embrionario. “Se pudo diferenciar químicamente a los lípidos en cada fase del embrión porque ellos funcionan como firmas químicas de las etapas del desarrollo”. En los desarrollos participaron investigadores de Innovare, la investigadora Roseli Gonçalves y el profesor José Visintin, de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ) de la USP, además de Peter Bols, de la Universidad de Amberes, en Bélgica, Gary Killian, de la Universidad Estadual de Pensilvania, en Estados Unidos, y el médico veterinario Marcos Achilles, de la firma Achilles Genetics, de la localidad de Garça, en el interior paulista.
Roseli Gonçalves, de la USP, quien desarrolla un proyecto de investigación en el programa Jóvenes Investigadores en Centros Emergentes de la FAPESP, dice que el proceso de fecundación todavía no está definido completamente, de ahí la importancia de los resultados obtenidos en las investigaciones. Durante su doctorado, que llevó a cabo en la FMVZ de la USP con beca de la FAPESP, ella estudió en el John Almquist Research Center, de la Universidad Estadual de Pensilvania, donde trabajó con marcadores de fertilidad bajo la supervisión de Gary Killian. Al finalizar el doctorado, participó en un proyecto coordinado por Killian, en cuyo marco se logró el aislamiento de una proteína denominada osteopontina, presente en mayor cantidad en los toros de las razas lecheras con alta fertilidad. “Observamos el efecto de esa proteína en la producción in vitro de embriones bovinos y en el congelamiento del semen”, dice Gonçalves, que trabajó en ese proyecto hasta el final de 2004.
Laboratorio de biología de la reproducción animal/ UFABCSistema de evaluación por espectroscopia RamanLaboratorio de biología de la reproducción animal/ UFABC
En la Universidad Federal del ABC (UFABC), campus de Santo André, en la Región Metropolitana de São Paulo, la profesora Marcella Pecora Milazzotto se mantiene desde 2010 al frente de las investigaciones con embriones bovinos en colaboración con Herculano da Silva Martinho, graduado en Física. El primer proyecto tuvo como objetivo el análisis de la interacción de la luz de un láser de baja intensidad con materiales biológicos. “Empleamos el láser para estimular espermatozoides, ovocitos y embriones bovinos y obtuvimos resultados interesantes con el gameto femenino [las células reproductoras]”, dice Milazzotto. “Conseguimos activar vías importantes de señalización dentro de las células durante el proceso de maduración de ese gameto. Notamos que la luz influye tanto en la producción como en la activación de proteínas presentes en esos ovocitos”.
Más allá de ese proyecto, el grupo también trabaja con análisis por espectroscopia Raman, cuando se emplea un haz de luz para recabar información química y estructural de materiales biológicos. En una de las investigaciones que se efectuaron, el objetivo consistía en descubrir lo que les faltaba a los embriones de laboratorio para asemejarse a los naturales. Para eso se realizaron comparaciones. “Empleamos las mismas técnicas que se emplean en la reproducción humana, tales como morfología embrionaria, evaluación de la velocidad del embrión para desarrollarse dentro del laboratorio y análisis por espectroscopia Raman de los embriones del laboratorio y de los producidos en campo”, relata Milazzotto. Y todos los datos surgidos de la espectroscopia se compararon con los del metabolismo energético, de grasa y estrés para intentar seleccionar los más viables. El descubrimiento condujo a la universidad a realizar un depósito de patente.
Laboratorio InnovareAnálisis embrionario mediante la técnica MaldiLaboratorio Innovare
En la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidade Estadual Paulista (Unesp) de Botucatu, Fernanda da Cruz Landim, del departamento de Reproducción Animal y Radiología Veterinaria, coordina proyectos de investigación con el objetivo de obtener informaciones relacionadas con la biología básica de los embriones bovinos para lograr una mejora en técnicas importantes destinadas a la comercialización del producto, tales como el aumento de la producción embrionaria in vitro y la crioconservación, que es el congelamiento de los embriones excedentes en el proceso de transferencia. En uno de los proyectos se efectuó una comparación de la expresión génica ‒el proceso en que la información codificada por un gen se decodifica en una proteína‒ entre embriones de las razas nelore (Bos taurus indicus) y simmental (Bos taurus taurus) producidos en laboratorio y extraídos de la vaca. “Elaboramos un modelo general de la expresión génica y seleccionamos varios genes diferentes involucrados en el metabolismo lipídico”, relata Landim.
Para el análisis de las muestras, se utilizó la espectrometría de masas Maldi. “Cuando aplicamos la técnica de Maldi para el análisis del perfil lipídico, con el objetivo de seleccionar embriones que podrían ser mejor crioconservados, notamos que existe un perfil diferente en relación con los lípidos de la raza nelore y la simmental producidos in vivo e in vitro”. Los embriones con las mejores cualidades para resistir el proceso de congelamiento fueron los de la raza simmental producidos en campo.
Proyectos
1. Análisis del perfil proteico y lipídico de embriones preimplantatorios bovinos obtenidos mediante fecundación in vitro, transferencia de embriones y por transferencia nuclear de células somáticas por la técnica de espectrometría de masas (nº 2010/ 01077-9); Modalidad Jóvenes Investigadores en Centros Emergentes; Investigadora responsable Roseli Fernandes (USP); Inversión R$ 629.986,73 (FAPESP).
2. Metabolómica para el análisis no invasivo de embriones bovinos producidos in vitro (nº 2012/ 10351-2); Modalidad Ayuda a la Investigación – Regular; Investigadora responsable Marcella Pecora Milazzotto (UFABC); Inversión R$ 174.631,10 (FAPESP).
3. Comparación del modelo de la expresión génica global de embriones Bos taurus indicus y Bos taurus taurus producidos in vitro (nº 2010/ 09922-0); Modalidad Ayuda Regular; Investigadora responsable Fernanda da Cruz Landim (Unesp); Inversión R$ 140.442,19 (FAPESP).
Artículos científicos
Gonçalves, R. F. et al. Analysis and characterisation of bovine oocyte and embryo biomarkers by matrix-assisted desorption ionisation mass spectrometry imaging. Reproduction, Fertility and Development. 11 jul. 2014 (online).
Sudano, M. J. et al. Phosphatidylcholine and sphingomyelin profiles vary in Bos taurus indicus and Bos taurus taurus in vitro and in vivo produced blastocysts. Biology of Reproduction. v. 87 (6), p. 130. dic. 2012.
