Dos investigadores de la Universidad de São Paulo (USP) desarrollaron una tecnología inédita en Brasil para diagnósticos clínicos basados en la utilización de reacciones que emiten luz y permiten medir el nivel de varias enzimas de interés de los laboratorios. La presencia y la cantidad de esas enzimas determinan la existencia de una enfermedad relacionada con ellas. Con las nuevas técnicas, las enzimas crecen y provocan reacciones químicas en sustancias orgánicas, llamadas sustratos, el punto central del estudio de los equipos de los profesores Luiz Henrique Catalani, del Instituto de Química, y Ana Campa, de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas.
En la investigación, fue posible sintetizar los sustratos utilizando una materia prima más sencilla y más barata que aquellos productos importados que están disponibles en el mercado. Campa destaca también que el objetivo es crear sustratos menos tóxicos para los profesionales del área de análisis clínicos y para su descarte en los efluentes, al margen de ser más prácticos, sensibles y estables. Según Catalani, esos sustratos son moléculas que poseen una estructura principal fija y una parte variable, en función del tipo de enzima que actuará sobre ellos. “La acción de la enzima sobre el sustrato dispara una serie de reacciones que culminan en la producción de luz.”
La emisión total de luz del sistema no puede observarse a simple vista. Debe ser medida por un equipo denominado luminómetro. El resultado puede verse en un gráfico en el cual la intensidad de la luz emitida es comparada con una curva patrón, permitiendo así obtener informaciones sobre la cantidad de enzimas presente, por ejemplo, en la porción de sangre analizada. La enzima actúa como un marcador conectado en la ocasión a un anticuerpo, en un proceso llamado de enzimainmunoensayo (EIA), que puede indicar la presencia de una enfermedad.
Enzima de la pancreatitis
La acción enzimática puede ser verificada en un examen de fluido corporal – suero sanguíneo o cualquier otro – para la identificación de la actividad de una enzima que indica la existencia de una enfermedad. Un ejemplo es la pancreatitis, que genera un aumento en el nivel de la enzima lipasa en la sangre. “Ese aumento puede ser detectado si se utiliza un sustrato que pueda ser reconocido por la lipasa”, dice Catalani.
Cuando el médico tiene alguna duda sobre cualquier patología del páncreas, suele pedir un análisis de lipasa pancreática. “Quizás solo un laboratorio de São Paulo haga ese análisis como base en el nuevo procedimiento. La mayor parte usa aquellos que denominan como marcadores secundarios – otras enzimas que marcan la patología”. Para ello, realizan el ensayo a partir de una mezcla de aceite de oliva y agua. Cuando la lipasa es adicionada a esa mezcla se produce una alteración en la composición turbia de la mezcla que puede determinar la actividad de la lipasa en el suero. “Nuestro proceso es mucho más sensible y más preciso.”
Además de los radioisótopos
Otro uso de la tecnología con enzimas en análisis clínicos es la sustitución de los radioisótopos como marcadores para verificar la presencia en el organismo de un antígeno – virus o bacteria, por ejemplo. En los radioinmunoensayos (RIA), en uso desde los años 50, los anticuerpos son previamente producidos, aislados y marcados con un elemento radioactivo. Durante el ensayo, éstos se unen al antígeno formando un complejo que es separado del medio de análisis. Según Catalani, esta técnica ha perdido terreno gradualmente en los últimos 20 años, dando lugar al uso de los enzimainmunoensayos.
“Hubo un gran avance de los radioinmunoensayos durante mucho tiempo, incluso con una facilitación del trabajo. Pero esa técnica es muy cara, por varios aspectos, entre ellos la producción y el descarte del radioisótopo, la necesidad de un esquema especial de seguridad en el laboratorio y las normas laborales que deben ser observadas”.
El investigador ejemplifica ese cambio con el trabajo del equipo con relación a la enzima ALP (fosfatasa alcalina), que hidroliza (reacciona con el agua) fosfatos: “La parte del sustrato variable es un fosfato, que tuvo su estructura alterada de forma tal que la enzima pase a reconocer el sustrato. Podemos ahora desarrollar una metodología que, en vez de radioisótopo, utilice un sustrato sencillo, barato y eficiente para cuantificar la acción de la enzima en un inmunoensayo con medida de quimioluminescencia. Este tipo de tecnología ha borrado a los radioinmunoensayos del mercado”, afirma Catalani.
Marcar anticuerpos
Ana Campa explica que la tercera utilidad de las técnicas desarrolladas por el grupo es la marcación de anticuerpos por enzimas en diversos procedimientos. En las técnicas de identificación de proteínas y fragmentos de ADN y ARN, que son preparados en un gel (polímero orgánico) de electroforesis, el revelado es una etapa crucial. Pese a los inconvenientes, ese revelado ha sido hecho con radioisótopos: “Como alternativa a esa técnica, se pueden utilizar enzimas como marcadores, con la consecuente emisión de luz para la evaluación de los resultados”.
Catalani y Campa desarrollan otros trabajos con Luiz Marcos da Fonseca e Iguatemy Lourenço Brunetti, de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad Estadual Paulista (Unesp) de Araraquara, y Roberto Passetto Falcão, de la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto de la USP, que tiene una colección de células de leucemia para investigaciones. En uno de los trabajos, se constató que un sustrato desarrollado por el grupo tiene posibilidades de ser usado en la clasificación de algunos tipos de leucemia.
En la identificación de esas enfermedades, en un primer momento el personal del laboratorio analiza el formato de las células blancas de la sangre. A continuación, son realizadas pruebas de las características y acciones químicas de esas células. Para algunos tipos, la enzima esterasa pasa a ser un marcador importante. De acuerdo con Ana, uno de los sustratos creados por el equipo permite una diferenciación de la actividad de la esterasa en monocito (tipo de célula blanca) en relación con otros tipos de células. “En base a ello, proponemos un método para la clasificación de algunos tipos de leucemia.”
Sin patentes
El trabajo que reveló la posibilidad de identificar tipos de leucemia ya ha sido publicado, así como también lo fueron otros sobre enzimas marcadoras de enfermedades, lo que imposibilita el patentamiento de los procesos. Catalani se lamenta: “Durante algún tiempo, intentamos reunir las condiciones para patentarlos, pero en esa época aún no existía el Núcleo de Patentes y Licencias de Tecnología (Nuplitec) de la FAPESP. Además, teníamos que presentar los resultados del proyecto”. Con todo, el grupo tiene otras líneas de investigación en marcha, pasibles de obtener patentes. Son la continuación del desarrollo de nuevos sustratos que servirán para nuevos tipos de análisis clínicos.
El Proyecto
Biotecnología Clínica: Desarrollo de Sistemas Quimiluminiscentes Disparados por Enzimas y su Aplicación en Diagnóstico Clínico (nº 97/04957-3); Modalidad Línea regular de auxilio a la investigación; Coordinador Luiz Henrique Catalani; Inversiones R$ 79.596,66 y US$ 81.340,00
