LÉO RAMOSUn cardumen de pez cebra: modelo de estudios para la formación de los atrios y ventrículosLÉO RAMOS
Unos pequeños peces con bandas horizontales criados en un acuario del Laboratorio Nacional de Biociencias (LNBio), en Campinas, está revelando mucho sobre la conformación y evolución del corazón humano. Al final del mes de junio, luego de meses de estudiar los mecanismos de activación de genes en los músculos del corazón del diminuto pez cebra (Danio rerio), José Xavier Neto y su equipo finalizaron una serie de experimentos que reforzaron su hipótesis de que la estructura del corazón de los seres humanos, con cuatro cámaras internas separadas por válvulas que regulan el flujo sanguíneo, podría haber surgido hace al menos 500 millones de años, mucho antes del surgimiento de la propia especie humana, hace 2 millones de años. El corazón del hombre, por lo tanto, habría surgido incluso antes que el hombre.
Las implicancias de tal conclusión resultan un tanto desconcertantes. “Nuestro corazón prácticamente es el mismo, en términos evolutivos, que el de la lamprea”, asegura Neto. A la luz de la importancia y del significado del corazón humano, no resulta muy agradable pensar en esa similitud, dado que la lamprea es un pez alargado y primitivo, al que fácilmente se puede considerar feo, sin aletas ni maxilar, y cuya boca es una ventosa circular del mismo diámetro del cuerpo. A Xavier Neto no parece importarle esa proximidad. “Desde el punto de vista de la cladística”, dice, refiriéndose al sistema de clasificación de los seres vivos basado en la relación evolutiva entre las especies, “nunca dejamos de ser peces. Somos peces modificados, las aletas se transformaron en brazos y piernas”.
Los peces primitivos como la lamprea ya presentan un corazón con cuatro cavidades, pero organizados en forma secuencial, y no en un bloque único, tal como el corazón humano. En otra especie evolutivamente muy antigua, que podría haber surgido hace unos 400 millones de años, el pez de barro americano o pez salamandra escamoso [Lepidosiren paradoxa], un pez que habita en la Amazonia (también hay un ejemplar en el laboratorio de Campinas), alargado como una serpiente y dotado de pulmones, el corazón ya es más evolucionado, con un tabique interno que separa la sangre oxigenada de la sangre carbonatada. En opinión de Neto, lo más importante, a despecho de la forma, es que el trayecto del flujo sanguíneo en el corazón ya forma una especie de S, más pronunciada en los peces y más sutil en los seres humanos.
LÉO RAMOSLos colores del corazón: del pez…LÉO RAMOS
Por medio de experimentos con peces cebra, que en Brasil también son denominados paulistinhas y resultan bastante más simpáticos que la lamprea, en ratones, codornices y gallinas, el equipo de Campinas ha analizado la formación de las cámaras internas del corazón, los atrios y ventrículos, esenciales para el almacenado o distribución de la sangre que circula por el organismo. Al cabo de casi dos décadas de trabajo se arribó a la conclusión de que los dos tipos de cámara del corazón serían el resultado de la actividad del ácido retinoico. Se trata de un efecto por oleadas, a veces más intensa, a veces menos, en momentos específicos del desarrollo embrionario. Según él, cuando entran en contacto con el ácido retinoico, las células aún poco especializadas reciben instrucciones para organizarse bajo la forma de un reservorio de sangre, es decir, un atrio. Cuando no detectan nada, forman una fuerte bomba propulsora de sangre, en este caso, un ventrículo.
Se trata de estructuras muy diferentes: el atrio, con superficie lisa, funciona como un reservorio que se infla al recibir la sangre. Las proteínas responsables de su contracción, las miosinas, son lentas. El ventrículo, de superficie rugosa y paredes más gruesas, de mayor tamaño que el atrio, con miosinas de acción rápida, puede contraerse con fuerza para lograr que la sangre llegue a todas las células del cuerpo. El corazón humano ‒un órgano con un tamaño similar al de un puño cerrado, que pesa 250 gramos (g) en las mujeres adultas y 300 g en los hombres adultos, que late 100 mil veces por día, bombeando alrededor de cinco litros de sangre‒ posee dos atrios por encima de los ventrículos.
Los estudios del equipo de Campinas y otros en esa línea están colaborando para la comprensión del origen de los problemas cardíacos asociados con el ácido retinoico, un derivado de la vitamina A bastante utilizado en la industria cosmética. “Si una mujer lo utiliza al comienzo de la gestación, resulta casi inevitable que se produzca una malformación. Por eso los médicos solicitan un test de embarazo antes de recetar ácido retinoico para tratamientos de la piel”, dice Xavier Neto, un carioca graduado como médico en la Universidad Federal de Ceará. “El ser humano es extremadamente sensible al ácido retinoico, pero sin él no estaríamos aquí. Todo depende de la dosis y del lugar donde actúe”. La posibilidad de prevención y la corrección de los problemas cardíacos por ahora son remotas, porque el ácido retinoico actúa en las primeras semanas de la gestación, cuando la mujer, generalmente, aún no sabe que se encuentra embarazada.
Con los experimentos más recientes, ni bien fueron publicados, Neto pretende reforzar su hipótesis y refutar los planteos antagónicos de otros equipos interesados en dilucidar los mecanismos que definen el tamaño, la forma y el modo de funcionamiento de cada cámara cardíaca. En 2008, un artículo publicado por el equipo de Deborah Yelon, quien actualmente trabaja en la Universidad de California en San Diego, Estados Unidos, morigeró el rol del ácido retinoico, que tan sólo estaría asociado al tamaño del corazón, y le asignó mayor valor a la proteína que se produce a partir del gen Hox-B5, que también incide en el desarrollo del intestino y de los pulmones, basándose en experimentos con peces cebra. “Cuando leí ese paper”, recuerda Neto, “casi terminé llorando”. “A causa de la instancia en que se hallaba mi trabajo en 2008”, dice Neto, “sabía que demoraría en refutarlo”.
léo ramos…e del ratónléo ramos
En 2005, como investigador del Instituto del Corazón (InCor) de la Universidad de São Paulo (USP), Neto y su equipo habían presentado su hipótesis al respecto de la formación y evolución de los compartimientos de la sangre en el corazón de los vertebrados. Basándose en una serie de experimentos con una amplia variedad de organismos, como por ejemplo, la Ciona intestinalis, un invertebrado marino cilíndrico que es el pariente vivo más cercano a los vertebrados (la formación del corazón de ese grupo, los tunicados o urocordados, es similar en sus fases iniciales a la del desarrollo del corazón de los vertebrados), el equipo proponía que el corazón con cámaras de los vertebrados podría haber surgido a partir de modificaciones en un tubo cardíaco equivalente al de la C. intestinalis, que es capaz de realizar movimientos similares a los del intestino cuando impulsa al bolo alimenticio durante el proceso de digestión. “Ciertos animales, tales como la langosta y otros crustáceos constituyen otro modelo para la constitución de las cámaras cardíacas, porque poseen solamente una cámara y son mucho más rápidos, por ejemplo que los onicóforos, helmintos dotados tan sólo de un tubo peristáltico sencillo”, afirma. “Las cámaras cardíacas son un atributo de los vertebrados, presentan contracción simultánea y se encuentran separados por válvulas, todo ello dentro de una membrana, el pericardio”. Con todo, no bastaba con una argumentación coherente. “Yo sabía que aún tendría que probar mis hipótesis”, dice. “Tuve que aguardar seis años hasta repetir los experimentos y demostrar el papel del ácido retinoico”.
Incluso ahora, con mayores argumentos, Neto sabe que tendrá que bregar bastante para lograr que prevalezca su enfoque; si no lo consigue, podría ser desestimado o incluso olvidárselo. “Las hipótesis evolutivas difícilmente pueden probarse”, acota. Además, el corazón engaña fácilmente a quien procura comprenderlo. El médico romano Claudio Galeno, uno de los fundadores de la medicina occidental, afirmó que el corazón estaba conformado por un tejido especial. Casi 1.500 años después, Leonardo da Vinci, después de diseccionar cadáveres, al igual que Galeno, y realizar varios dibujos de la anatomía del corazón, sentenció: “El corazón es el principal músculo en cuanto a su fortaleza”. Ya constituyó un avance, pero otros equívocos persistieron. Durante siglos se pensó que por las venas fluía aire, puesto que estaban vacías en los animales y personas muertas. Un siglo después de Da Vinci, el médico inglés William Harvey describió la circulación de la sangre minuciosamente, revelando que las venas, así como las arterias, transportaban sangre y no aire.
SCIENCE PHOTO LIBRARYLas cuatro cámaras del corazón, representadas por Da Vinci: el artista enmienda el error de Galeno, quien imaginaba tan sólo dos cámarasSCIENCE PHOTO LIBRARY
Al igual que otros científicos contemporáneos, Xavier Neto también tomó caminos equivocados. Ni bien arribó a la Universidad Harvard para realizar su posdoctorado, en 1997, se sintió atraído, casi inevitablemente, por la idea entonces en boga, de que un único gen podría ser capaz de definir la formación del corazón. Había un gen que era considerado candidato, pero los experimentos ‒incluso sin ese gen, los ratones nacían con el corazón desarrollado, aunque morían inmediatamente después‒indicaban que el corazón dependía de muchos genes para formarse. Entonces se rindió. “Es algo mucho más complicado de lo que pensábamos”.
Luego de ello, Neto logró reunir animales transgénicos y reactivos apropiados ‒que poco a poco iban cayendo en manos de la coordinadora del laboratorio, Nadia Rosenthal‒ para planificar los experimentos que podrían arrojar luz acerca de la constitución del corazón. “Incluso si fracaso, pensé, estaré agradecido de observar el desarrollo del embrión”, recuerda él. “Y como estaba dando mis primeros pasos en la biología del desarrollo, podría observar con mis propios ojos los procesos de desarrollo de los órganos, sin hallarme contaminado por el exceso de lecturas de artículos científicos”.
Neto comenzó entonces a analizar cómo era que la expresión de la enzima betagalactosidasa podía indicar la actividad del ácido retinoico en diferentes regiones del corazón de embriones de ratones de nueve días de gestación. “Casi se me despega la retina intentando observar lo que no existía en los embriones de los ratones”, dice. Poco a poco, él fue notando claramente el patrón de coloración definido por la activación del ácido retinoico: “Dependiendo de la expresión de la enzima, las regiones del corazón se tornaban verdes, indicando que el ácido retinoico estaba actuando en esa área, como activador o supresor de varios genes”.
Él se percató de que hasta el séptimo día de la gestación, que demora 21 días, el corazón aún no se había desarrollado, ni había ninguna señal de la actividad del ácido retinoico en los tejidos cardíacos. Dos días después, el corazón ya se había delineado como un tubo, se producía una descarga de ácido retinoico y se formaba el atrio. Inmediatamente después, el ácido retinoico desaparecía y se formaba el ventrículo. Otros experimentos, con codornices, señalaron que, sin ácido retinoico, el atrio no se formaba y, de modo complementario, el exceso de esa sustancia impedía la formación del ventrículo. “El ácido retinoico es un actor que ingresa y sale de escena en la misma obra, con roles diferentes”, dice Neto.
“De hecho, el ácido retinoico es un actor clave en la formación de las cámaras cardíacas”, acota Didier Stainier, coordinador de un equipo de la Universidad de California en São Francisco (UCSF), que estudia el desarrollo del corazón en peces cebra. En 2002, Stainier y Deborah Yelon, que trabajó en su laboratorio, estudiaron el papel del ácido retinoico en una etapa previa del desarrollo: junto a otras moléculas, podría inducir la formación de un tejido embrionario primordial denominado endodermis (el corazón se formará a partir de otro tejido, la mesodermis). En su opinión, Neto se ha ubicado a la vanguardia de esas investigaciones que, sin duda, conducirán a insights adicionales con respecto al proceso de desarrollo del corazón”.
LÉO RAMOSEmbrión de gallina: bajo el efecto del ácido retinoicoLÉO RAMOS
Incluso después de que se forma el corazón, ese actor versátil permanece en escena. En 2011, investigadores de la Universidad Duke, en Estados Unidos, revelaron que el ácido retinoico, debido a su capacidad de inducción de la multiplicación celular, facilitaba la regeneración del endocardio, la capa interna de las paredes cardíacas. El modelo experimental era nuevamente el zebrafish, una especie que se utiliza desde hace décadas porque las hembras producen muchos huevos, que se recolectan con facilidad, y el embrión se forma a partir de una única célula, tan sólo un día después de la fertilización.
Luego de dos años en Harvard, Xavier Neto retornó feliz al InCor, y dispuesto a montar un grupo de investigación en genética del desarrollo embrionario y continuar trabajando como en los dos años que permaneció en Harvard. La primera dificultad con la que se topó, fue conseguir ratones, que no llegaban en la cantidad ni en el plazo esperados. No se resignó, y preguntó dónde podría adquirir huevos de gallina fertilizados e incubadora, para que el trabajo no se detuviera. Varios años antes, y con la misma avidez científica, él había cazado sapos para realizar los experimentos previstos en su pasantía del primer año de la carrera de medicina en Fortaleza. “Yo ya quería ser investigador desde mis días en la facultad”, dice, comentando a continuación, que le gustaban mucho las disciplinas básicas, como por ejemplo la bioquímica, mientras que los aspirantes a médicos habitualmente fruncen la nariz con eso. A él ya le atraía el mundo de la ciencia desde antes, cuando acompañaba a su padre, que era profesor de bioquímica en la universidad, a los laboratorios e invernaderos de plantas. “¿Recuerdan el kit Os cientistas, de la década de 1970? Yo los tenía todos. Me muevo en ese mundo desde temprano”.
A Neto le demandó cinco años montar su propio equipo y el laboratorio que necesitaba para retomar el ritmo de trabajo que anhelaba. “Si me quedo sólo, estoy perdido”, concluyó. “Network es todo”. Por medio de test en gallinas y codornices, él comprobó que la actividad del ácido retinoico, a su vez, estaba regulada por la enzima RALDH2. “Describí qué y cuándo sucedía”, dice. Y ya no cesó de comprobarlo en otros animales ‒gusanos marinos, caracoles, la
ngostas y otros‒ para analizar los procesos evolutivos del desarrollo del corazón y, a partir de 2010, cuando se trasladó al LNBio, prosiguió con la producción de linajes de animales transgénicos, en su mayoría por encargo, para experimentos de otros investigadores y de su propio grupo. Incapaz de detenerse, en agosto recorrió nuevamente la Chapada de Araripe, en el estado de Ceará, en busca de fósiles de peces con edad promedio de 120 millones de años que, al examinarlos mediante tomografía, podrían revelar algo más con respecto a la evolución del corazón.
Proyecto
Evolución y desarrollo de las cámaras cardíacas (nº 06/ 50843-0); Modalidad Apoyo a la Investigación – Regular; Investigador responsable José Xavier Neto (LNBio); Inversión R$ 311.558,83 (FAPESP).
Artículos científicos
SIMÕES-COSTA M. S. et al. The evolutionary origin of cardiac chambers. Developmental Biology. v. 277, n. 1, p. 1-15. 2005.
MOSS, J. B. et al. Dynamic patterns of retinoic acid synthesis and response in the developing mammalian heart. Developmental Biology. v. 199, p. 55-71. 1998.
WAXMAN, J. S. et al. Hoxb5b acts downstream of retinoic acid signaling in the forelimb field to restrict heart field potential in zebrafish. Developmental Biology. v. 15, n. 6, p. 923-34.
YELON D. e STAINIER, D.Y. Pattern formation: swimming in retinoic acid. Current Biology. v. 12, n. 20, p. 707-9.
