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MICROBIOLOGÍA

La fortaleza que brinda la unión

Físicos y biólogos investigan cómo se agregan las bacterias Xylella fastidiosa en un biofilme

Los filamentos de EPS se proyectan a partir de biofilme en imágenes coloreadas obtenidas mediante el microscopio de fluorescencia

Richard Janissen/ Universidad Delft de Tecnología Los filamentos de EPS se proyectan a partir de biofilme en imágenes coloreadas obtenidas mediante el microscopio de fluorescenciaRichard Janissen/ Universidad Delft de Tecnología

“¿Qué son esas células largas?”, indagó la física Mônica Cotta, mostrando imágenes de la bacteria Xylella fastidiosa producidas en los potentes microscopios del Instituto Nacional de Fotónica Aplicada a la Biología Molecular (Infabic), en la Universidad de Campinas (Unicamp). La pregunta evocó un recuerdo casi olvidado de antiguos estudios de la bióloga Alessandra de Souza, investigadora del Centro de Citricultura Sylvio Moreira del Instituto Agronómico de Campinas (IAC). Cuando atraviesan una situación de estrés, diversas bacterias suprimen la producción de la proteína que las separa en dos luego de la replicación. Se trata de la denominada filamentación, que ahora parece ser una propiedad fundamental en la formación del biofilme que torna temible a este microorganismo: el agregado bacteriano ocupa y bloquea el xilema (los vasos que transportan agua y otras sustancias desde la raíz hacia el resto de las partes de la planta), provocando serios daños en el desarrollo de las plantas y en la producción de frutos. El grupo describió la formación del biofilme en un artículo que se publicó en abril en la revista Scientific Reports y prosigue en la búsqueda de las formas de derrotar a esos viejos enemigos de los citricultores brasileños y de los productores norteamericanos de uvas, e invasores recientes de los olivares italianos. Las posibilidades de éxito pueden residir, al menos en parte, en la cooperación interdisciplinaria. En opinión  del físico Carlos Lenz Cesar, vicecoordinador del Infabic, el triunfo del instituto se basa en que congrega a investigadores con especialidades distintas. “Cada uno de ellos debe profundizarse en su área, aportando al conjunto a través de la colaboración”, sostiene.

Cuando Cotta comenzó a analizar la Xylella en su microscopio de fluorescencia, no obtenía buenas imágenes porque el brillo que emitían las bacterias –del cual depende el instrumento– era muy débil. Eso mejoró con la sugerencia que le hiciera De Souza, de insertar en las bacterias la proteína verde fluorescente (GFP, según su sigla en inglés), que se transformó en el marcador de mayor éxito en los estudios biológicos porque emite un brillo mucho más intenso. A pesar de eso, el dispositivo no permitía el estudio de organismos vivos y faltaba interpretar a los pequeños círculos verdes, que también se observaban en el microscopio de fuerza atómica del grupo de la física. La pista fundamental surgió de la percepción avezada de la investigadora para utilizar la microscopía para el estudio de materiales. “La bacteria sólo puede tener tal simetría si se encuentra ‘de pie’, es decir, ubicada en forma vertical”, imaginó (vea las imágenes en la página 52). Lo que observaba sería la extremidad del organismo visto desde arriba. Y resolvió probar con otros tipos de microscopía.

El microscopio confocal del Infabic, capaz de generar imágenes tridimensionales, era prometedor, pero las bacterias vivas seguían viéndose como manchas. La solución apareció cuando llegó el microscopio confocal con detección vía spinning disk, que posee un disco que gira a alta velocidad, repleto de perforaciones equipadas con lentes a través de las cuales pasan haces de luz láser que barren la muestra. “En algunos segundos podíamos producir imágenes tridimensionales, en lugar de los varios minutos necesarios en el confocal tradicional”, relata la física. Su grupo –especialmente el biólogo alemán Richard Janissen, por entonces en el laboratorio realizando una residencia de posdoctorado y ahora en la Universidad Delft de Tecnología, en Holanda, y el físico doctorando colombiano Duber Murillo–, comenzó a examinar placas de cultivo de Xylella a lo largo de todo su ciclo de vida, y así dilucidó una parte importante del comportamiento de la bacteria. La interpretación inicial de Cotta era correcta. “Las bacterias quedan ‘en pie’ y giran sobre la punta en contacto con la superficie”, explica, mostrando una oscilación similar a la de un muñeco tentetieso. Las imágenes se borraban debido al movimiento. “En ese microscopio pudimos producir 100 cuadros por segundo en tres dimensiones”, relata Lenz. “Atrapamos a la bacteria en el salto, como si se tratara de un helicóptero en vuelo que apareciera en la foto con sus aspas detenidas”.

052-055_Xylella_233La fluorescencia, tal como las firmas químicas que se detectaron en el microscopio Raman confocal de la Universidad de São Paulo (USP), reveló que en el inicio del proceso de colonización las bacterias excretan algo que se acumula en uno de sus extremos. Esas secreciones, a las que se conoce genéricamente como sustancias poliméricas extracelulares (EPS) poseen propiedades distintas según la etapa de desarrollo del biofilme. En un primer momento, las EPS solubles adhieren a la bacteria sobre el sustrato (en este caso, la placa de vidrio) en forma reversible. Bajo el microscopio, luego de limpiar la muestra, se observa una estructura en forma de volcán, donde se hallaba adherida la bacteria. A continuación, el organismo comienza a producir EPS capsular, que torna a esa unión irreversible y atrae a sus compañeras, formando conglomerados. Ése es el nacimiento del biofilme de Xylella, en el cual las bacterias van quedando inmersas en una goma de EPS.

En las imágenes secuenciales de la formación del biofilme, Janissen divisó a las bacterias largas entre conglomerados de bacterias vecinas, algo que luego se explicó con el nombre de filamentación. “Los conglomerados probablemente producen una señal química y algunas bacterias de la periferia comienzan a replicarse sin dividirse”, explica Cotta. El resultado son bacterias alargadas que segregan EPS, atraen compañeras y aceleran la formación de una comunidad compacta. Según la física, es la primera vez que se describe este proceso, al que se conoce como filamentación, en biofilmes bacterianos. La investigadora descubrió algo que parece ser el mismo fenómeno en el material anexo de un artículo sobre la bacteria del cólera, publicado en 2012 en la revista Science por un grupo estadounidense. “Observé un video en el cual, de repente, aparecían los filamentos; pero los autores no mencionan nada”, comenta Cotta. No basta con que la información sea visible: es necesario que alguien la note.

Otro aspecto del ciclo de vida de la bacteria apareció gracias al microscopio confocal, que permite virtualmente girar la muestra y analizarla por debajo, donde el biofilme se adhiere a la placa de Petri. El mismo queda sujeto solamente por algunos puntos, aquellas bacterias iniciales que se anclaron al sustrato a través de una de sus extremidades. Esa estructura puede facilitar la transmisión de la enfermedad por medio del insecto vector responsable de la transmisión de la enfermedad. “Es muy factible que la cigarrita (el insecto vector) arranque una porción del biofilme cuando succiona la savia de la planta infectada”, imagina Cotta, por el momento en forma especulativa. Resta comprobar si eso es lo que realmente sucede; por ahora se trata de una de esas pistas que la comprensión física puede aportarle a los biólogos. “Lo que detectamos no contradice lo que la Xylella necesita tener in vivo”.

En la práctica
Ahora Murillo intenta determinar cuáles componentes son necesarios en el medio de cultivo para la adherencia de las bacterias. Se trata de un proceso exploratorio, donde el físico va retirando componente por componente y luego vuelve a agregarlo, mientras observa la reacción de los cultivos de Xylella. En broma, Cotta lo califica como “trabajo de biólogo”. La idea consiste en elaborar un modelo de adherencia que permita darle un tratamiento más experimental al problema y buscar, por ejemplo, impedir la formación del biofilme.

Perpendiculares al sustrato, las bacterias segregan sustancia adherente (EPS)

Richard Janissen/ Universidad Delft de Tecnología Perpendiculares al sustrato, las bacterias segregan sustancia adherente (EPS)Richard Janissen/ Universidad Delft de Tecnología

Uno de los objetivos radica en comprender cómo la sustancia N-acetilcolina (NAC) impide que la Xylella fastidiosa ocasione daños severos a las plantas, tal como reveló el grupo de De Souza en 2013 (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 214). Por ahora, Cotta supone que la NAC, presente en jarabes expectorantes, podría actuar sobre las EPS solubles, impidiendo que la adhesión se torne irreversible. Eso porque fue en ese momento inicial de la formación del biofilme, que el físico indio Prasana Sahoo, quien trabajaba en el laboratorio de la Unicamp en una pasantía de posdoctorado, agregó NAC a una muestra que observaba bajo el microscopio confocal y notó que las bacterias se soltaban del sustrato.

Dicha observación fue un hallazgo fortuito de la investigación de Sahoo. Éste coloca bacterias sobre una superficie repleta de nanohilos atravesados, que se asemeja a una cama de clavos en miniatura. Las EPS forman un tejido que se apoya sobre los hilos, que a su vez registra la fuerza ejercida por el biofilme.

De acuerdo con Cotta, esos avances fueron posibles mediante la combinación de diferentes dispositivos y técnicas de microscopía que poco a poco van permitiendo hallar las piezas del rompecabezas. Nada nuevo para la física de los materiales. “Tan sólo trasladamos ese razonamiento para la microbiología”, dice.

La Xylella fastidiosa, causante de graves perjuicios para la producción brasileña de naranjas, recientemente llegó al sur de Italia y tiene aterrorizada a la región de Apúlia, donde los olivos centenarios (y hasta milenarios) son patrimonio nacional. En 2013, el virólogo vegetal Donato Boscia, del Consejo Nacional de Investigación italiano en Bari, se topó con olivos secos en un huerto y se abocó a hallar la causa. Luego de consultar a colegas en Italia y otros países, llegó a la Xylella fastidiosa. Al comienzo de 2014, una investigadora del grupo vino a Cordeirópolis, en el interior paulista, para aprender a aislar la bacteria con el ingeniero agrónomo Helvécio Della Coletta-Filho, a cargo de la clínica fitopatológica del Centro de Citricultura. A su regreso a Italia, ella lo logró rápidamente. “Nunca vi un grupo que avanzara tanto en investigación en tan poco tiempo”, comenta De Souza.

La comparación genética entre las muestras de Xylella de diferentes regiones del mundo indica que la bacteria de los olivares habría llegado a Europa junto con plantas ornamentales (adelfas) oriundas de Costa Rica. La relación cultural de los italianos con los olivos convierte a la invasión bacteriana en un problema social, además de económico. “Algunos llegaron a desconfiar de los propios investigadores que descubrieron la enfermedad”, comenta De Souza, que en octubre del año pasado viajó a Bari para presentar su trabajo con la NAC. Según ella, el grupo europeo ya ha comenzado a investigar el efecto de la sustancia, con resultados prometedores. “Las plantas absorben la NAC, pero aún es necesario comprobar si eso reduce la infección”.

En Apúlia, De Souza y Coletta-Filho observaron huertos secos y conversaron con habitantes locales angustiados por la pérdida de los olivos. Mientras no exista un compuesto eficaz para combatir la enfermedad, un anillo de protección de fumigación intensiva busca impedir que las cigarritas portadoras de la bacteria avancen hacia el norte, donde se concentra el grueso de la producción de aceite.

Proyecto
Análisis estructural y químico de biofilmes de Xylella fastidiosa (nº 2010/51748-7); Modalidad Apoyo a la Investigación – Regular; Investigadora responsable Mônica Alonso Cotta (Unicamp); Inversión R$ 187.406,00 (FAPESP).

Artículo científico
JANISSEN, R. et al. Spatiotemporal distribution of different extracellular polymeric substances and filamentation mediate Xylella fastidiosa adhesion and biofilm formation. Scientific Reports. v. 5, n. 9856. 20 abr. 2015.

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