Eduardo CesarCultivo de piel artificial realizado por investigadores de la USP: el objetivo es la creación de un kit comercial para pruebas de cosméticosEduardo Cesar
Va cobrando fuerza en el país una articulación entre laboratorios públicos, grupos de investigación y entes gubernamentales para la reducción o el reemplazo del uso de animales en pruebas de seguridad y eficacia de productos. El esfuerzo se intensificó en 2012, mediante la creación a cargo del gobierno federal de la Red Nacional de Métodos Alternativos (Renama) y el lanzamiento de un llamado a la presentación de propuestas del Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), que contempló a 10 proyectos de investigación en la esfera del Renama. Todos ellos se encuentran en marcha y abarcan enfoques diversos, tales como la producción de kits de piel artificial para test de sensibilidad de cosméticos, estudios con larvas capaces de sustituir a los mamíferos en exámenes de toxicidad o la disminución del número de roedores en el control de calidad de vacunas. Tres laboratorios forman parte del núcleo central de Renama. Uno de ellos es el Laboratorio Nacional de Biociencias (LNBio), en Campinas. Los otros se encuentran en Río de Janeiro: el Instituto Nacional de Control de Calidad en la Salud (INCQS), vinculado a la Fundación Oswaldo Cruz, y el Instituto Nacional de Metrología, Calidad y Tecnología (Inmetro).
En el mes de marzo, esa estructura que aún se encuentra en fase de consolidación asumió el desafío de cumplir una meta ambiciosa: brindar soporte para la sustitución progresiva, durante los próximos cinco años, del uso de animales en los test, siempre que exista una alternativa válida. Para los nuevos métodos aún no validados, ese proceso involucrará al Centro Brasileño de Aprobación de Métodos Alternativos (Bracvam) y toda la estructura de Renama. La sustitución fue una decisión del Consejo Nacional de Control de la Experimentación Animal (Concea), una institución colegiada vinculada al Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación (MCTI), que desde 2009 es responsable de establecer normas para la experimentación animal en Brasil y sustituir los animales para propósitos científicos y didácticos cuando existan recursos alternativos. En mayo, el Concea recibió del Bracvam la primera recomendación de métodos alternativos convalidados y aceptados internacionalmente. Son 17 técnicas, que abarcan sensibilidad cutánea, fatiga ocular y potencial de irritación y toxicidad. “La resolución permitirá que el país efectivamente adopte métodos alternativos en test de agrotóxicos, cosméticos y medicamentos”, dice el coordinador del Concea, José Mauro Granjeiro.
Eduardo CesarProducción de piel artificial por el grupo de la profesora Silvya Stuchi-Maria Engler, de la USPEduardo Cesar
El mayor potencial para la sustitución de animales por métodos alternativos no se encuentra en las investigaciones científicas de índole académica, sino en los test que exigen las agencias de regulación para garantizar la seguridad y la eficacia de productos. “Los experimentos con animales realizados para investigar hipótesis científicas son ideados en forma independiente por los investigadores: cada uno plantea una pregunta específica y concibe un conjunto peculiar de experimentos para responderla. Por lo tanto, resulta mucho más difícil estandarizarlos”, explica Eduardo Pagani, investigador y gerente de desarrollo de fármacos del LNBio. “En tanto, las pruebas que exigen las agencias de todo el mundo para cosméticos y otros productos se realizan siempre de acuerdo con métodos estándar. En ese caso existe mayor libertad para proponer alternativas que no utilicen animales”, agrega. La exigencia de los test in vivo para el registro de medicamentos y cosméticos comenzó en la década de 1960, luego del famoso accidente con la sustancia denominada talidomida. Ese medicamento se comercializó en todo el mundo, recomendado para combatir las náuseas en embarazadas. Miles de madres que lo utilizaron tuvieron hijos con malformaciones. En tanto, el movimiento para sustituir los modelos animales por métodos alternativos cobró relevancia a partir de 2003, cuando Europa propuso desterrarlos en los test de cosméticos, y se demoró dos décadas para su implementación.
Los proyectos que contemplan métodos alternativos avalados por el MCTI en 2012 se dividieron en dos vertientes. En una de ellas, la meta fue la identificación de grupos que ya trabajaban con métodos alternativos, apoyando los estudios que llevaron a cabo. Se seleccionaron nueve proyectos de grupos de trabajo en São Paulo, Bahía, Goiás, Río de Janeiro, Santa Catarina y Rio Grande do Sul. Una segunda vertiente tenía un objetivo específico: desarrollar capacidad en Brasil para la producción a escala industrial de kits de cultivos de piel humana, que son utilizados por la industria cosmética para las pruebas de seguridad de sus productos, pero cuya importación se ha convertido en un problema en el país. Sucede que los kits con células vivas caducan en pocos días y la demora en los trámites aduaneros, con frecuencia torna inviable su adquisición, lo cual implica que las industrias deban realizar sus test en el exterior.
El proyecto contemplado fue el de un grupo de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la USP, conducido por Silvya Stuchi-Maria Engler, que comenzó a producir piel artificial a mediados de los años 2000, con el apoyo de la FAPESP (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 166). La piel, que se produce a partir de células extraídas de donantes, reproduce los mismos tejidos biológicos de la humana y puede emplearse para evaluar la toxicidad y eficacia de nuevos compuestos para fármacos y productos cosméticos. En un principio, la investigación con cultivos de piel buscaba brindar soporte a otra línea de investigación en la que Engler trabaja: el estudio de moléculas capaces de detener al melanoma, un tumor de piel muy agresivo. “Luego nos dimos cuenta de que la piel podría ser de utilidad para las empresas”, afirma. “Los kits representan una alternativa para los ensayos con cosméticos, pero cabe recordar que el uso de animales sigue siendo imprescindible, por ejemplo, en los test de desarrollo de medicamentos”, añade Engler.
Eduardo CesarPiel artificialEduardo Cesar
El Instituto Butantan, con su finalidad de desarrollar y producir sueros y vacunas, está reduciendo el número de animales tales como ratones y cobayas conejillos de Indias que utiliza para el control de calidad. Ese empeño ha conducido, entre otros avances, a una reducción de más del 60% en el uso de ratones en test de calidad de la vacuna recombinante contra la hepatitis B, gracias a la creación de un test inmunoenzimático con funciones equivalentes. El trabajo del instituto lo habilitó para presentar un proyecto en el pliego de la Renama, que contempla varios métodos alternativos para el control de calidad de vacunas y sueros. En uno de los frentes en que se investiga, el objetivo consiste en reducir la cantidad de animales en los test de lotes de la vacuna contra la difteria y el tétanos, mediante la adopción de un ensayo in vitro para detectar su efecto inmunológico. En otro, la meta radica en la sustitución de las pruebas en cobayas por ensayos en células para el control de la anatoxina diftérica, la toxina de la difteria con efecto inmunológico, aunque ésta no sea tóxica. Un tercer enfoque consiste en la adopción, para las vacunas que produce el instituto, de un kit que reemplaza el uso de conejos en los test de pirógenos, contaminantes que provocan fiebre y pueden provenir de microorganismos o conglomerados proteicos. En cuarto lugar, se pretende reducir el uso de ratones en la serología para la vacuna contra el coqueluche [tos convulsa o ferina], donde se plantea utilizar para la enfermedad a los mismos animales empleados para probar las dosis de anticuerpos contra la difteria y el tétanos. La reducción de las cifras es radical: de 170 animales por lote de vacuna a tan sólo seis cobayos.
Por último, el Butantan está teniendo éxito con una técnica potencialmente capaz de sustituir el uso de ratones por un ensayo inmunoenzimático en una etapa de la producción de la vacuna contra la rabia. “La disminución y sustitución del uso de animales es un camino sin retorno”, dice el químico Wagner Quintilio, investigador del Instituto Butantan que está a cargo de ese proyecto. “La sociedad y los comités de ética en la investigación presionan para que no se permita el uso exagerado de animales. También hay presión desde el punto de vista económico. La cría de animales en condiciones adecuadas cuesta caro y requiere mucho espacio”, sostiene.
En tanto, el proyecto del grupo que lidera la micóloga Maria José Giannini, docente de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de Araraquara, de la Universidade Estadual Paulista (Unesp), contempla la creación del Centro para el Desarrollo y Homologación de Métodos Alternativos (Cedevam), con el objetivo de generar y probar técnicas que reduzcan el uso de animales. Giannini supervisa a la posdoctoranda Liliana Scorzoni, quien desarrolla una investigación sobre modelos capaces de sustituir mamíferos por otros organismos en los test de virulencia de microbios y eficacia de drogas. El frente más avanzado es el del Galleria mellonella, una especie de insecto lepidóptero, cuya larva es útil para comprobar la acción de determinadas sustancias. “Su manejo es sencillo y podría minimizar el uso de animales”, dice Giannini, quien también es miembro del Consejo Superior de la FAPESP. “La larva posee células similares a las del sistema inmunológico. Cuando se le inyecta una sustancia tóxica, reacciona y se oscurece”, afirma. Se espera que el Galleria pueda reemplazar a otros animales, tales como ratas y ratones, al menos en alguna de las etapas de los test de toxicidad y virulencia.
Eduardo CesarZebrafish, cuya larva podría sustituir a los animales en los test de toxicidad: modelos alternativosEduardo Cesar
Otro modelo alternativo que se encuentra en la mira del grupo de la Unesp es el C. elegans, un nemátodo de un milímetro de largo sensible a la infección por bacterias y hongos patógenos. “Posee un sistema inmunológico que reconoce y elimina los patógenos muy similar al de los vertebrados. Además, su genoma ha sido completamente secuenciado, algo aún no realizado con el Galleria”, afirma Giannini. Ambos modelos se encuentran en fase de prueba para evaluar la virulencia de los hongos Paracoccidioides, endémicos en América Latina. También se evaluarán otros modelos, como por ejemplo el danio cebra. En 2010, la Prorrectoría de Investigación de la Unesp, cuya titular es la profesora Giannini, organizó en São Paulo un congreso internacional para debatir alternativas a los test de toxicidad en animales, que convocó a autoridades tales como Thomas Hartung, director del Centro de Alternativas a los Test en Animales, de la Universidad Johns Hopkins. “La búsqueda de modelos alternativos también es importante para el desarrollo de métodos más eficientes. Los modelos con animales presentan limitaciones y, a veces, no resultan suficientes para garantizar la seguridad, como puede comprobarse con algunos medicamentos aprobados que terminan siendo retirados del mercado”, dice Giannini.
La decisión del Concea de impulsar el reconocimiento de métodos alternativos aprobados fue en respuesta a una petición de la organización no gubernamental Humane Society International, que reivindicaba la prohibición de las pruebas para cosméticos en animales. En el estado de São Paulo, esos ensayos están prohibidos por una ley estadual sancionada en enero de 2014. El Concea, que no aceptó la solicitud, estimó que acelerar la implementación de técnicas alternativas redundará en una mayor reducción del uso de animales que si sólo se prohibiera terminantemente el uso de animales para probar cosméticos, puesto que prácticamente ya no se utilizan animales con esa finalidad. “La prohibición total pondría en jaque la seguridad de la población”, dice el médico y biofísico Marcelo Morales, docente de la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ) y ex coordinador del Concea. “Ello podría tornar inviable el desarrollo de cosméticos con nuevos componentes o moléculas descubiertas en nuestra biodiversidad que contengan contaminantes desconocidos”, afirma. Según Luiz Henrique do Canto Pereira, coordinador general de biotecnología y salud del MCTI, su desaparición podría perjudicar la estrategia definida por el MCTI consistente en la sustitución, reducción y optimización del uso de animales en pruebas siempre que eso sea posible. “La campaña por su prohibición echa por tierra el esfuerzo que estamos haciendo desde 2011, cuando comenzamos a concebir esa iniciativa, para organizar en el país una red estructurada, capaz de validar y difundir en forma más amplia los métodos alternativos, que incluyen no sólo a los cosméticos, sino también a los fármacos y agrotóxicos”, afirma. “Incluso en Europa existen salvaguardias que permiten la realización de pruebas en casos de riesgo para la salud de la población”.
Algunos consideran apresurado el plazo de cinco años para la sustitución estipulada por el Concea. “Recientemente comenzamos a invertir en el desarrollo de métodos alternativos en Brasil y ahora corremos el riesgo de perderlo todo si no obtenemos resultados inmediatos”, dice Maria José Giannini, de la Unesp. “Las empresas, presionadas por el plazo, podrían importar técnicas en lugar de utilizar la expertise nacional. Eso ya está ocurriendo ahora. Las empresas de cosméticos afirman que no realizan pruebas con animales en Brasil. Pero lo hacen en otros países, para garantizar la seguridad de sus productos”, explica.
Eduardo CesarCultivo de células para el ensayo de citotoxicidad para anatoxina diftérica que reemplaza al uso de cobayos en el control de calidad de la vacuna contra la difteriaEduardo Cesar
El coordinador del Bracvam, Octavio Presgrave, espera que las prácticas aceptadas internacionalmente tengan una rápida aprobación. “Para su validación interna deberá demostrarse que los registros obtenidos en el exterior se reproduzcan en los ensayos efectuados en nuestros laboratorios”, afirma. Presgrave se desempeña como investigador en el Instituto Nacional de Control de Calidad en la Salud (INCQS). A su juicio, el plazo de cinco años es algo factible. “Es un plazo suficiente como para que las empresas y los laboratorios se adapten”, dice. En otros casos, el trabajo del Bracvam será más lento. Ése es el caso, por ejemplo, del protocolo Het-Cam, que plantea la sustitución del uso de conejos por una membrana del huevo de gallina para la identificación de compuestos corrosivos o muy irritantes. Ese método, concebido en Europa, en 1985, tan sólo se acepta como pre ensayo en Francia y Alemania. El proceso del Het-Cam será el primer estudio de homologación en Brasil siguiendo parámetros internacionales, afirma Presgrave. “Cuando dejamos de utilizar animales en un test, se produce un logro ético importante. Pero un nuevo método también significa crear conocimiento. Desarrollamos innovaciones para la búsqueda de métodos más fidedignos y sensibles”, afirma.
En otro frente con miras a lograr la reducción del uso de animales en los test de laboratorio, el LNBio obtuvo recursos del MCTI para la creación de un núcleo de pruebas in silico, para disminuir el uso de animales en las pruebas con medicamentos. In silico alude al silicio que se emplea en los circuitos integrados y significa “en computadora”. Tal expresión se originó como una analogía con las expresiones in vivo e in vitro, que ya se utilizan desde hace tiempo. Los test in silico implican simulaciones en computadora para evaluar, por ejemplo, si las moléculas candidatas a nuevos medicamentos cumplen realmente con dicha función. “La computadora puede comparar la estructura de la molécula candidata con la de otras ya testeadas y cuyas características se encuentran almacenadas en bancos de datos para definir si vale la pena continuar con su desarrollo”, dice Eduardo Pagani, del LNBio. Estos test también pueden colaborar para evaluar si una determinada molécula, aun cuando tenga potencial, también cuenta con posibilidades de absorción por el organismo en caso de ser administrada por vía oral. Los cálculos clásicos refieren que entre 5 mil y 10 mil moléculas se evalúan inicialmente por su potencial actividad en un determinado blanco; 250 son sintetizadas y comienzan los test en animales; con cinco se inician los ensayos clínicos en humanos y tan sólo una llega al mercado como nuevo medicamento. “La idea subyacente en los test in silico es lograr incluso una mayor disminución de la cantidad de sustancias que pasan al test en animales, mediante la eliminación rápida de aquéllas que se muestran inviables. Se trata de un filtro que evita el desperdicio de tiempo, recursos financieros y, principalmente, el uso injustificado de animales en proyectos previsiblemente destinados al fracaso”.
El LNBio divulgó el mes pasado los resultados de un pliego les abrió a empresas, institutos de investigación y universidades la posibilidad de realizar test in silico en el laboratorio. Se recibieron 19 propuestas de siete empresas. “Todas fueron aprobadas y, en los próximos meses, comenzaremos con los test”, dice Tiago Sobreira, investigador en bioinformática del LNBio, quien se encarga de la parte operativa de los test in silico. Las empresas manifestaron su interés por participar en la convocatoria y ahora negociarán los términos de esa participación, que incluye la protección de secretos industriales. Entre los contemplados hay laboratorios, tales como Farmanguinhos, Cristália y Eurofarma, y fabricantes de cosméticos, como por ejemplo Boticário y Natura. “Quienes desarrollan fármacos, refieren que para sacar un producto al mercado se tardan 15 años y cuesta mil millones de reales. Brasil registra un déficit comercial farmacéutico de 6 mil millones de reales por año. Necesitamos generar un esfuerzo público para que los brasileños desarrollen los medicamentos aquí”, dice Pagani.
La implementación de métodos alternativos depende de la existencia de laboratorios reconocidos en las denominadas buenas prácticas de laboratorio (BPL), pero todavía son pocos los que hay en Brasil. “Las buenas prácticas contribuyen para su rastreabilidad y, por consiguiente, para la confianza en el estudio realizado. La confiabilidad de los métodos alternativos también estará garantizada mediante la realización de comparaciones entre los laboratorios de Renama”, dice el coordinador del Concea, José Mauro Granjeiro, quien dirige esa área en el Inmetro. Recientemente, el Inmetro coordinó una comparación entre cinco laboratorios integrantes de la red, con el apoyo de una consultora internacional con experiencia ‒el Centro Europeo para la Homologación de Métodos Alternativos (Ecvam, según su sigla original en inglés)‒, cuyos resultados están siendo analizados.
La ampliación de los estudios sobre métodos alternativos dependerá de un esfuerzo en la financiación a los grupos de investigación participantes, sostiene Luiz Henrique Canto, del MCTI. “Hemos logrado diagramar una estructura y comenzamos a avanzar, el MCTI no está escatimando esfuerzos, e incluso busca apoyo en el Congreso para el fortalecimiento de la Renama. Creemos que esta iniciativa será capaz de aportar grandes beneficios al desarrollo científico y tecnológico del país en el área de las ciencias de la vida”, afirma.
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