LÉO RAMOS
Larvas de Aedes aegypti en desarrollo en un laboratorio con el objetivo de formar un linaje transgénicoLÉO RAMOSNo fue la playa lo que atrajo al virólogo Paolo Zanotto, del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (ICB-USP), y al doctorando Julian Villabona-Arenas, a Guarujá, en el litoral sur de São Paulo, durante el verano de 2012-2013. Ellos estaban haciendo un seguimiento de los casos de dengue en ese municipio. Debido a su cercanía con la metrópolis paulistana, estaban seleccionado y analizando la genética de los virus para reconstruir la malla de transmisión entre personas. Los análisis mostraron que dos barrios, Pae Cará y Enseada, eran los principales focos de la enfermedad, que desde éstos se propagaba hacia otros puntos de la ciudad. El trabajo de los investigadores llamó la atención de una funcionaria del departamento de vigilancia sanitaria local, quien se percató de la importancia de saber dónde estaban los casos con virus activos y convocó a una unidad de fumigación –apodadas “fumacê”– para la eliminación de mosquitos en esos locales. “Fueron a la cabeza del dragón y dispararon”, dice Zanotto. Luego de ello, los mapas muestran una situación de más fácil control, con casos aislados. “Eso es lo que hay que hacer en todos los municipios”, preconiza, al tiempo que hace hincapié en la necesidad de combinar vacunas con distintas formas de control del mosquito transmisor de la enfermedad.
El trabajo del grupo de Zanotto ha venido apuntando caminos en el combate contra el dengue y poniendo de relieve el riesgo creciente de las epidemias. Un motivo de alerta es la presencia de los cuatro serotipos del virus que observaron en Guarujá durante aquel verano, tal como se muestra en el artículo de 2014 en PLoS Neglected Tropical Diseases. Probablemente tiene impacto la cercanía del puerto de Santos, donde mosquitos y virus desembarcan como pasajeros clandestinos. En Jundiaí, muy cerca de la Región Metropolitana de São Paulo, los investigadores encontraron únicamente los serotipos 1 y 4, pero eso no llega a ser un alivio. Juntos, ambos municipios ya revelaban que la capital paulista está sujeta a la acción de múltiples virus, lo cual crea una situación conocida como hiperendemicidad, que aumenta el riesgo de que una persona sea infectada varias veces, con mayor riesgo de casos del tipo hemorrágico. “La presencia de los cuatro serotipos en un brote en una de las áreas más densamente pobladas de Brasil es un hallazgo perturbador”, afirma Villabona-Arenas. “Esta co-circulación sólo había sido documentada en países del sudoeste de Asia hace décadas y más recientemente en la India, siempre asociada con la mayor gravedad de la enfermedad entre niños.”
En efecto, las cifras más recientes no permiten relajarse, aunque el miedo inmediato al mosquito Aedes aegypti, transmisor de la enfermedad, comienza a quedar relegado a un segundo plano con la llegada del frío y de la sequía, que no favorecen el desarrollo de las larvas. La región sudeste fue el escenario del 66% de los casi 746 mil casos registrados por el Ministerio de Salud en todo el país desde el comienzo de 2015 hasta el 18 de abril. Es menos de lo que fue registrado en 2013, pero mucho más que en 2014. En ese total existen grados de gravedad: están los que apenas si sienten síntomas, y otros que tienen fiebre alta y persistente y pasan largos días prostrados, con fuertes dolores en el cuerpo y náuseas que hacen imposible seguir la prescripción médica de tomar mucho líquido. Durante ese período, se confirmaron 414 casos graves y 5.771 con señales de alarma, las categorías que requieren atención médica. Es mucho más que el año anterior, con una alta proporción en el estado de São Paulo. Entre los factores de gravedad se encuentran los daños al hígado y una disminución alarmante de la concentración de plaquetas en la sangre, que puede transformar cualquier lesión microscópica en una hemorragia.
Para Zanotto, los números y la situación de hiperendemicidad indican una progresión alarmante de la enfermedad. “El dengue está recién empezando en Brasil”, evalúa, con base en un gráfico de la cantidad de casos desde 1995, que prevé una escalada abrupta a partir de ahora. Esto significa, a su juicio, que los esfuerzos contra las epidemias deben volverse más eficaces. “Deberíamos hacer como un cuerpo de bomberos, que actúa en focos de incendio para contenerlos antes de que se propaguen y queden fuera de control.”
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El brillo verde en la cabeza y en la cola de las larvas es el marcador que indica cuáles son los insectos genéticamente modificadosLÉO RAMOSLos estudios de Zanotto en municipios paulistas tales como Guarujá, Jundiaí y São José do Rio Preto localizan focos de dengue en áreas con indicadores socioeconómicos más bajos. Pero no basta con concentrar esfuerzos en las favelas, tal como lo muestra estudio del biólogo Ricardo Vieira Araujo, actual funcionario de la coordinación de Cambios Globales del Clima del Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación (MCTI), publicado este año en la revista Brazilian Journal of Infectious Diseases. En São Paulo, Vieira Araújo mostró que en partes de la ciudad con un temperatura superficial del suelo significativamente más alta, y en donde hay baja humedad, poca cobertura vegetal y altos niveles de impermeabilización del suelo –las llamadas islas de calor– hay una mayor incidencia de dengue.
Entre 2009 y 2013, Vieira Araujo trabajaba en la coordinación de Vigilancia en Salud de São Paulo, en el monitoreo de enfermedades transmitidas por vectores y zoonosis en la ciudad. “Yo me preguntaba por qué una favela en la zona sur registraba tantos casos, en tanto que en otra de la zona norte, por ejemplo, con características similares, las cifras eran mucho menores”, explica. Durante ese mismo período, la Secretaría Municipal de Medio Ambiente concluyó un mapeo de la temperatura superficial del suelo que apuntaba dónde estaban las islas de calor en la capital. “Pero muchos de los investigadores ponderaban que las propias islas estarían en regiones con indicadores socioeconómicos más bajos, con una densidad poblacional mayor. Entonces tal vez la causa no residiese en las temperaturas sino en las condiciones sociales y demográficas.”
Para distinguir entre los factores, se hizo necesario echar mano de una serie de informaciones. El censo 2010 del IBGE permitió calcular la población, la densidad poblacional, los ingresos promedio y el modo predominante de ocupación urbana en los 96 distritos administrativos de São Paulo. Los datos también indicaban dónde estaban las favelas, las ocupaciones y los conventillos. Con imágenes de satélite, fue posible analizar la cobertura vegetal, así como crear un mapa con las temperaturas medias en la superficie de toda la ciudad. Los registros de casos autóctonos de dengue provinieron de la coordinación de Vigilancia en Salud, que entre 2010 y 2011 registró alrededor de 7.400 casos.
La integración de la información mostró que el 93% de los casos se registraron donde la temperatura superficial promedio pasaba de los 28 grados Celsius (°C). En las zonas con mayor cobertura vegetal, la cantidad de casos por cada 100 mil habitantes era sólo 3,2, ante 72,3 en las menos arborizadas. Sumando todo, el tipo de ocupación parece tener menor influjo sobre la incidencia de dengue que la temperatura en el período analizado.
Pero el estudio fue más a fondo e incluyó también un experimento en laboratorio con dos linajes de A. aegypti: uno que usan rutineramente los investigadores y otro extraído de huevos recogidos en el campus de la USP. Quedó clara la influencia de la temperatura: cuando alcanza los 32°C, más del 90% de las larvas del insecto pasaron a la fase adulta.
El investigador advierte que los mapas de las islas de calor no son estáticos y se haría necesaria una actualización constante de los datos. De todos modos, considera importante que los profesionales de la salud y de infraestructura urbana actúen de manera integrada. “La expansión de las áreas verdes es una posibilidad. Pero, cabe recordar que existen otras alternativas, tales como las que se ponen en práctica en poblados del litoral del mar Mediterráneo, donde se pintan las casas de blanco, como una manera de mitigar el calor. Debemos emplear los recursos que tenemos para combatir el dengue en forma estratégica e integrada”, pondera.
Un virus alado
Uno de los recursos existentes para el combate contra el mosquito es el uso de insecticidas, como en el caso de Guarujá. El problema radica en que, debido a que es la estrategia más utilizada, el A. aegypti desarrolló resistencia a los insecticidas más comunes, a base de piretroides, así como no se espantan con la mayor parte de los repelentes y siguen revoloteando nerviosamente alrededor de sus víctimas embadurnadas. Durante su doctorado en la Universidade Estadual Paulista (Unesp) de Botucatu, la bióloga Maria de Lourdes Macoris monitoreó una serie de poblaciones de mosquitos en el interior paulista y verificó que, aun tras 15 años sin piretroides, la resistencia se mantuvo. “El uso de insecticidas seleccionó las poblaciones resistentes”, explica el biólogo Paulo Ribolla, su director de tesis. “Algunas alcaldías actualmente están usando otros productos con mayor éxito”. En su laboratorio, ahora está implementando una tecnología destinada a producir mosquitos mutantes e investigar cuáles son los genes responsables de la resistencia.
En la carrera evolutiva contra los mosquitos, es necesario buscar nuevos insecticidas que sean eficaces y que actúen de manera amplia en los criaderos. Este objetivo impulsa desde 2007 al grupo de investigación coordinado por el ingeniero químico Eduardo José de Arruda, de la Universidad Federal de Grande Dourados (UFGD), en Mato Grosso do Sul. “Hicimos un mapeo con Aedes y con el zancudo Culex quinquefasciatus, y constatamos que estos insectos ya presentan resistencia a algunos tipos de insecticidas”, dice Arruda. “Se puede incluso matar a todos los adultos de una generación. Pero los huevos dejados en los criaderos, pese a la pérdida de viabilidad, podrán hacer eclosión y derivar en la recuperación de la población en cuestión de meses.”
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Una vez alineados…LÉO RAMOS“Las clases de insecticidas con respecto a las cuales existe resistencia no deberían usarse más en el control”, dice Arruda, quien pone de relieve los costos económicos y ambientales de la cantidad creciente necesaria. El grupo que él coordinado apunta, junto con colaboradores de otras universidades, a la síntesis y a la caracterización de compuestos multifuncionales que impiden la eclosión de los huevos y matan a las larvas. También destruyen bacterias, hongos y protozoarios que constituyen la dieta de los mosquitos, y pueden interferir en la comunicación química que atrae a las hembras a los criaderos donde depositan sus huevos. La idea es encontrar estrategias destinadas al control de dos o tres generaciones de insectos al mismo tiempo y romper su dinámica reproductiva.
Como su acción es más abarcadora, los compuestos multifuncionales demandan cuidados. Durante su maestría en la UFGD, Taline Catelan analizó los efectos de cuatro insecticidas fenólicos sobre huevos de Aedes y en Artemia salina, un pequeño crustáceo que vive en el agua. “La Artemia sirve como un indicador de los eventuales daños a los reservorios de agua”, dice Arruda. El estudio, publicado este año en Advances in Infectious Diseases, mostró que uno de los compuestos impidió completamente la eclosión de los huevos del mosquito, pero afectó a las poblaciones de Artemia.
Más prometedores aún son los resultados de los estudios con insecticidas metálicos, que contienen cobre o hierro. Estos compuestos desencadenan una reacción de estrés oxidativo que puede causar daños letales en las células y en los tejidos. “Es como si usásemos un caballo de Troya para llevar el compuesto al interior de las células, y el metabolismo activo del insecto produjese in situ el insecticida”, dice Arruda.
Durmiendo con el enemigo
Debido a la eficacia incierta de los insecticidas, es necesario buscar otras armas. El laboratorio de la bioquímica Margareth Capurro, del ICB-USP, se concentra directamente en los pequeños insectos de patas rayadas de una manera inusitada: produciendo miles y miles de ellos para soltarlos en el ambiente. “Me convertí en una consultora mundial en producción masiva de mosquitos”, comenta la investigadora, quien durante la elaboración de este reportaje viajó a China precisamente a tal fin. En una fábrica con sede en la localidad de Juazeiro, en Bahía, Capurro trabajó con Moscamed Brasil para implementar la producción de un linaje desarrollado por la empresa británica Oxford Insect Technologies (Oxitec). Esos mosquitos genéticamente alterados acumulan una proteína que hace que las células de las larvas entren en colapso, de manera tal que no llegan a la fase adulta (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 180). El año pasado, su equipo publicó en Journal of Visualized Experiments un video en el cual se mostraba la producción, incluso la laboriosa separación de crisálidas masculinas y femeninas según su tamaño (las hembras son mayores).
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…a los huevos se les aplican inyecciones que inducen modificaciones genéticasLÉO RAMOSLa separación es necesaria porque solamente a los machos, que no pican y no portan el virus, se los suelta en la naturaleza para que se crucen con las hembras silvestres y produzcan la descendencia modificada e inviable. Para lograr esa reproducción, Moscamed cedió toda la infraestructura y la logística. La empresa también selló asociaciones con el Ministerio de Salud y con la Secretaría de Salud del Estado de Bahía, que ha contribuido para financiar la iniciativa. Al comienzo, el equipo contaba hasta con un periodista para ayudar en la comunicación con la población local. “No podíamos llegar a la ciudad y soltar mosquitos sin más”, dice Capurro. “Íbamos a la casa de la gente para charlar y explicar el proyecto; usamos la radio, la televisión, la comunicación local.”
Pero no porque la producción exista, la investigación termina. Los mosquitos de Oxitec siguen siendo testeados en laboratorio para ver de qué modo se comporta el virus del dengue en el huésped. Con ese conocimiento, es necesario siempre volver al campo, en un proceso constante. “En el potecito todo funciona, pero en el ambiente, ¿el mosquito alterado vuela tanto como el silvestre?”, se cuestiona la investigadora. Y sí, vuela: ella ya lo ha observado. Otro problema consiste en producir machos compatibles con la población femenina del sertón bahiano. En el laboratorio crecen demasiado, como cualquier animal alimentado a discreción sin necesidad de esfuerzo. Fue necesario estimar la cantidad de larvas que deben desarrollarse en un determinado volumen de agua, y cuánto alimento debe dárseles.
Las pruebas realizadas en Juazeiro, hasta 2013, y en Jacobina, que empezaron ese mismo año, han mostrado que el sistema funciona, pese a algunos percances. “La frecuencia de cópula es más baja, por eso debemos aumentar la cantidad de mosquitos”. La liberación debe ser constante, pero con ajustes semanales en la población de los insectos. Con los transgénicos, la cantidad disminuyó en toda la ciudad. Pero Capurro advierte que es necesario mantener los esfuerzos en busca de los criaderos.
La colaboración con los agentes de salud apuntó la necesidad de mejorar el procedimiento. “Ellos encuentran criaderos con larvas y no pueden saber si son viables”, dice la investigadora. La idea fue invertir en el desarrollo de machos estériles en el laboratorio. Como la hembra copula tan sólo una vez en su vida y almacena el líquido seminal, basta un encuentro con un macho estéril para que no sea capaz de producir una prole. Pero ese linaje transgénico aún no está en su punto justo, con tan sólo entre un 30% y un 40% de esterilidad. Es necesario más tiempo de cruzamientos controlados para arribar al producto final, según explica Capurro.
Otra manipulación genética en desarrollo apunta a impedir el nacimiento de hembras, un proceso llamado de reversión sexual que produce un linaje enteramente masculino. Esto incrementaría la productividad de la fábrica, ya que actualmente el 50% de las larvas corresponde a hembras y hay una pérdida en el proceso de separación de las crisálidas. “Perdemos entre un 15% y un 25% de los machos”, informa la investigadora. Si los dobles transgénicos ‒estériles y con reversión sexual‒ funcionan, no solamente la productividad mejorará. Actualmente es necesario transportar las larvas de machos en vehículos refrigerados hasta Jacobina. De tenerse la certeza de que sólo se producen machos, será posible enviar vía correo hojas de papel con los huevos adheridos.
Estos resultados son prometedores, pero pueden no ser suficientes. “Si eliminamos al mosquito, el dengue acaba; si solamente disminuimos la población, al cabo de algunos unos años, la enfermedad vuelve a atacar”, explica Capurro. Es lo que sucedió en Singapur a comienzos de la década pasada. Con una cantidad reducido de mosquitos, la proporción de insectos infectados aumenta. Como la resistencia humana también cae sin la exposición al virus, el riesgo que se corre es que resurja fuertemente la epidemia.
Por eso Capurro y el doctorando Danilo Carvalho proponen un combate contra el mosquito en dos etapas, tal cual lo explican en un artículo de 2014 publicado en Acta Tropica. Luego de reducir la población con machos estériles, la idea consistiría en soltar un segundo linaje, actualmente en estudio en el laboratorio, portador de una mutación que le permitiría al mosquito reconocer las células del propio sistema digestivo en las cuales los virus comienzan a replicarse, y destruirlas.
Una batalla interior
Por más que se combatan los mosquitos, la enfermedad no será erradicada fácilmente por eso se requiere la ayuda del sistema inmunológico. La inminencia de una vacuna ha sido alardeada, pero no estará disponible tan rápido. La más cercana es la elaborada por el laboratorio francés Sanofi Pasteur, que aguarda la aprobación de la Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria (Anvisa) para salir al mercado brasileño en 2016. Pero su eficacia no convence al microbiólogo Luís Carlos de Souza Ferreira, del ICB-USP. El científico explica que la base de esa vacuna es del virus de la fiebre amarilla. Sólo una parte del genoma responsable de las proteínas estructurales pertenece al virus del dengue.
“Se creía que fuese suficiente, pues, con base en esas proteínas, los anticuerpos reconocen al invasor”, explica. Pero su grupo y otros han demostrado que, en el caso del dengue, cuando los niveles de esos anticuerpos son bajos o son poco eficientes, los virus remanentes son llevados a las células donde se replican. La destrucción de esas células es tarea de los linfocitos T, y el objetivo principal son otras proteínas del virus: las no estructurales. “Nuestras investigaciones han demostrado que la respuesta de los linfocitos T es importante en el dengue”, comenta. A su juicio, eso no ocurre con la vacuna producida por Sanofi Pasteur.
Una de las líneas de investigación de Souza Ferreira apunta precisamente a producir una vacuna basada en una de esas proteínas, la NS1. Famosa porque constituye un marcador que indica que una persona plagada de dolores en el cuerpo está infectada con el virus del dengue, dicha proteína ha demostrado ser un buen blanco, tal como se informa un artículo de revisión de 2014 en Virus Research. “Produjimos NS1 en bacterias y la purificamos para usarla como componente de la vacuna”, comenta Jaime Henrique Amorim, investigador de posdoctorado y primer autor del artículo. “Obtuvimos un 50% de protección en las pruebas con ratones; es una formulación prometedora, aunque todavía está muy lejos de convertirse en un producto aplicable a los seres humanos.”
Aparte de esa faceta más aplicada, otra vertiente de los estudios llevados a cabo en el laboratorio apunta a entender el patrón de la respuesta inmunológica. Ese enfoque puede servir para evaluar y aconsejar el desarrollo de otras vacunas, y lleva a Souza Ferreira y a Amorim a considerar más prometedora la vacuna que se encuentra en fase de ensayos clínicos en el Instituto Butantan. “Estudios realizados en Estados Unidos demostraron que esa vacuna, basada en formas atenuadas de los cuatro tipos virales del dengue, provoca una respuesta parecida a la de las personas que fueron infectadas y lograron neutralizar el virus”, explica Amorim.
La vacuna, producida Brasil, se desarrolló en Estados Unidos, en los Institutos Nacionales de Salud (NIH). “En este momento estamos finalizando la fase II de estudio clínico”, comenta el médico Alexander Precioso, director del Laboratorio Especial de Ensayos Clínicos y Farmacovigilancia del Instituto Butantan. Precioso espera contar con todos los resultados recolectados, analizados y divulgados este mismo mes.
De acuerdo con Precioso, ya se ha testeado a 300 personas y se demostró que la vacuna es segura. Estos resultados llevaron al Butantan a enviar a Anvisa la solicitud de autorización para dar inicio a la fase III, antes incluso de reunir todos los datos recabados en la etapa anterior. “Necesitamos empezar cuanto antes el reclutamiento de voluntarios para poder vacunar antes de la próxima estacionalidad”, explica el médico. Si todo marcha bien, esto permitiría empezar la aplicación de la vacuna tan pronto como culmine la fase II. Este cronograma permitiría que la reacción inmunológica a la vacuna fuese puesta a prueba durante el próximo verano, la estación en que se registran los brotes de dengue en diversas regiones del país. Depende de que logren reclutar a los voluntarios, que deben ser 17 mil personas en todo el país, de las características del próximo brote y de cómo sea la respuesta de los inmunizados. El plan del Butantan consiste en solicitar el registro de la vacuna ni bien queden demostrados los datos de eficacia y mantener el seguimiento de los participantes durante al menos cinco años, para evaluar la durabilidad de la respuesta inmunológica y definir la necesidad y frecuencia de refuerzos de la vacuna.
Parece existir un cierto consenso: no hay una solución única en términos de estrategia ni de geografía. En ciudades como Río de Janeiro y São Paulo, la mayor incidencia se registra en verano, cuando hay más lluvias y la temperatura es elevada. En tanto, en el nordeste la enfermedad afecta a más gente durante el período de sequía, cuando el estiaje lleva a los habitantes más pobres a almacenar toda el agua que pueden, lo cual da origen a criaderos de A. aegypti. Por eso las autoridades sanitarias deben evaluar la situación de cada municipio para definir las estrategias de combate.
De cualquier manera, la acción precisa ser multifacética, con vacunas y combate contra los mosquitos de diversos tipos. Paolo Zanotto aboga para que se recaben datos de manera redundante para maximizar la eficacia de las intervenciones, con acción del gobierno, las universidades y la iniciativa privada. La integración y la propagación de información validada independientemente es lo que puede permitir una acción concertada para prevenir epidemias y dirigir la intervención a los efectos de economizar recursos. Si se conociesen bien las situaciones de riesgo, no sería necesario, por ejemplo, vacunar a toda la población, sostiene el virólogo. “Lo que yo hago tendría mayor impacto si hubiese interacción institucional efectiva. Es hora de pensar distinto y obrar de manera integrada: sin superposición, quedan lagunas.”
Proyectos
1. Evaluación y mejora de linajes transgénicos de Aedes aegypti para el control de la transmisión del dengue (nº 2013/19921-9); Modalidad Ayuda a la Investigación – Regular; Investigadora responsable Margareth Capurro Guimarães (ICB-USP); Inversión R$ 310.817,00 (FAPESP).
2. Producción de lotes experimentales de una posible vacuna tetravalente contra el dengue (nº 2008/50029-7); Modalidad Programa de Investigación para el SUS; Investigador responsable Isaias Raw (Instituto Butantan); Inversión R$ 1.926.149,72 (FAPESP/ CNPq-PPSUS).
3. Filogeografía del virus del dengue en los municipios de Jundiaí y Guarujá en el estado de São Paulo (nº 2010/19059-7); Modalidad Ayuda a la Investigación – Regular; Investigador responsable Paolo Marino de Andrade Zanotto (ICB-USP); Inversión R$ 229.608,82 (FAPESP).
4. Estrategias para vacunas orientadas al control del dengue basadas en proteínas recombinantes y adyuvantes de naturaleza microbiana (nº 2011/ 51761-6); Modalidad Ayuda a la Investigación – Regular; Investigador responsable Luís Carlos de Souza Ferreira (ICB-USP); Inversión R$ 813.542,17 (FAPESP).
Artículos científicos
AMORIM, J. H. et al. The dengue virus non-structural 1 protein: Risks and benefits. Virus Research, v. 181, p. 53-60. 6 mar. 2014.
ARAUJO, R. V. et al. São Paulo urban heat islands have a higher incidence of dengue than other urban areas. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 19, n. 2, p. 146-55. mar-abr. 2015.
CATELAN, T. B. S. et al. Evaluation of toxicity of phenolic compounds using Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) and Artemia salina. Advances in Infectious Diseases, v. 5, n. 1, p. 48-56. 28 feb. 2015.
CARVALHO, D. O. et al. Two step male release strategy using transgenic mosquito lines to control transmision of vector-borne diseases. Acta Tropica, v. 132 supl, p. S170-7. abr. 2014.
MACORIS, M. L. G. et al. Impact of insecticide resistance on the field control of Aedes aegypti in the State of São Paulo. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 47, n. 5, p. 573-8. sep-oct 2014.
VILLABONA-ARENAS, C. J. et al. Detection of four dengue serotypes suggests rise in hyperendemicity in urban centers of Brazil. PLoS Neglected Tropical Diseases. 27 feb. 2014.
