EDUARDO CESARLa convivencia no siempre es pacífica: colonias de X. citri (en amarillo) cultivadas junto a colonias de E. coli (en blanco) y C. violaceum (en rosa)EDUARDO CESAR
La bacteria Xanthomonas citri, causante de la cancrosis de los cítricos, una enfermedad que volvió a instalarse entre las plantaciones paulistas, pasa tan sólo una parte de su vida en el interior de las hojas y frutos de naranjos y limoneros. Bajo esa protección y atiborrada de alimento, ella se multiplica y estimula la proliferación de las células vegetales, generando lesiones emergentes y oscurecidas que, al romperse, la devuelven al ambiente. Sin embargo, durante buena parte del tiempo se encuentra expuesta a condiciones bastante menos confortables. En el suelo o en la superficie externa de las hojas, donde generalmente se encuentra, la competencia por el espacio y por nutrientes con otros microorganismos es acérrima. A pesar de eso, la Xanthomonas citri frecuentemente sale airosa, tal como lo demuestran los naranjales de Florida, en Estados Unidos, donde la producción descendió a la mitad en los últimos años por la difusión del cancro cítrico y de otra enfermedad, el huanglongbing [greening] o HLB.
Miles de años de evolución prepararon a la bacteria para lidiar con sus potenciales competidores. Su célula con forma de bastón se encuentra recubierta de filamentos ultradelgados que se asemejan a finos cabellos. Esas estructuras son parte de un mecanismo de defensa que destruye a otras bacterias. El bioquímico Shaker Chuck Farah y su equipo en el Instituto de Química de la Universidad de São Paulo (IQ-USP) demostraron que, por medio de un tipo específico de esos filamentos, la X. citri lanza un cóctel de compuestos tóxicos sobre sus potenciales competidores.
Los filamentos que se asemejan a cabellos, en realidad son canales ‒existen al menos seis tipos conocidos‒que conectan el medio interno de la bacteria con el exterior. Una variedad específica de esos canales, el denominado sistema de secreción del tipo IV (T4SS, según su sigla en inglés), está compuesta por más de una centena de proteínas y presenta la forma de una aguja. Ya se sabía que, por su intermedio, muchas especies de bacterias intercambian material genético con otras bacterias de la misma o de otras especies, un fenómeno al que se conoce como conjugación, que permite la transferencia horizontal de genes, asociada al desarrollo de resistencia a los antibióticos. Al menos una bacteria, Agrobacterium tumefaciens, transfiere ADN por medio del T4SS a su huésped, una planta, en la cual causa tumores a los que se conoce como agallas. También por medio de este sistema de secreción, algunas especies asociadas a enfermedades en animales y humanos inoculan proteínas que las ayudan a colonizar al huésped. Pero no se conocía la función del T4SS en la Xanthomonas citri y en las decenas de especies que componen la familia Xanthomonadaceae, de la cual forman parte las bacterias del género Stenotrophomonas, entre las que se encuentra la especie S. maltophilia, un patógeno oportunista que afecta a los seres humanos.
Estudios previos señalaban que en la familia Xanthomonadaceae, los canales T4SS eran distintos a los detectados en otros grupos de bacterias. Farah y su equipo también habían constatado que, en el caso de la X. citri, esa estructura no cumplía un rol esencial en la infección de la planta. Ahora, los investigadores de la USP verificaron que en esa bacteria el sistema de secreción IV sirve para inyectar alrededor de una decena de proteínas tóxicas (toxinas) diferentes en otras bacterias.
Diorge Souza/ USP
Con su sistema de secreción de toxinas íntegro, las bactérias Xanthomonas citri (en azul) dominan la coloniaDiorge Souza/ USPEsas toxinas digieren azúcares, proteínas y lípidos de la pared celular de bacterias competidoras, compeliéndolas a expulsar sus contenidos de una manera que, bajo el microscopio, a veces parece explosiva. En el laboratorio de Farah, los biólogos Diorge Souza y Gabriel Oka pusieron a convivir millones de células de X. citri con una cantidad similar de Escherichia coli, la bacteria que normalmente se encuentra en los intestinos de los mamíferos, y filmaron lo que ocurrió. En varias de las ocasiones en que la X. citri tocó la superficie de una E. coli, la pared celular de ésta última se rompió, extravasando su contenido, tal como puede comprobarse en un registro disponible en internet. “La bacteria se deforma cuando se ve comprometida la integridad de su pared celular”, explica Farah. “Es como un globo de festejo lleno de agua que estalla”, compara.
La secreción de toxinas se activa mediante el contacto, aunque aún no se sabe con certeza cómo es que la Xanthomonas reconoce a las bacterias de otras especies. No obstante, ella misma se encuentra protegida de los compuestos que produce. Souza y Oka comprobaron que la X. citri sintetiza antídotos contra sus propias toxinas. “Las antitoxinas se encuentran distribuidas por la pared celular de la Xanthomonas”, explica Souza. “Eso probablemente impide que ella sufra los daños”.
Atracción entre proteínas
Por cierto, fue una de esas antitoxinas la que años atrás le brindó a Souza una primera pista sobre la función del sistema de secreción del tipo IV en la Xanthomonas. En 2005, el químico Marcos Alegria, por entonces alumno de doctorado de Farah, había publicado un trabajo revelando que en la X. citri, una proteína específica ‒la VirD4‒ de ese sistema de secreción atraía a otras proteínas, todas con una función desconocida en la época, hacia el canal. Una de esas proteínas, que fue denominada con la sigla Xac2609, interactuó con la proteína Xac2610, cuya función también era desconocida. Tiempo después, luego de determinar la estructura tridimensional de la Xac2610, Souza buscó en los bancos de datos públicos otras proteínas con estructuras similares, que podrían indicar su función.
La primera que halló fue una proteína que bloquea la acción de la lisozima y funciona como antitoxina. Tal resultado sugería que el compañero de interacción de la Xac2610, la Xac2609, podría ser una lisozima, una proteína capacitada para digerir la cadena de azúcares de la pared celular de las bacterias. Luego de confirmar la acción de esas dos proteínas, Souza identificó otras potenciales toxinas y antitoxinas ‒en total son 13 del primer tipo y 7 del segundo‒ codificadas en el genoma de la X. citri, además de cientos de otras toxinas asociadas al sistema de secreción del tipo IV de otras especies de la familia Xanthomonadaceae.
Los test efectuados con bacterias de dos especies diferentes, la Micrococcus luteus y la Bacillus subtilis, confirmaron que la proteína codificada por el Xac2609 degrada la pared bacteriana. Y que ese efecto resulta anulado por la Xac2610, según un artículo que se publicó en marzo de este año en la revista Nature Communications. Pero restaba verificar si esa y otras toxinas también eran exportadas por el sistema de secreción IV. Entonces, Souza y Oka desarrollaron X. citri genéticamente modificadas para que no produzcan el T4SS y las cultivaron junto con bacterias E. coli que se multiplican con mayor velocidad, siendo que la E. coli se duplica cada 30 minutos, mientras que la X. citri requiere hasta cinco veces ese tiempo.
Diorge Souza/ USP
Sin él, la X. citri queda en desventaja y pierde espacio frente a la Escherichia coli (en amarillo)Diorge Souza/ USPSin su canal excretor, la X. citri quedó en desventaja. El experimento comenzó con cifras similares de las dos especies y finalizó con la E. coli dominando la colonia. Incluso reproduciéndose con mayor lentitud, la Xanthomonas volvió a prevalecer, eliminando a su competidora, cuando los científicos le restituyeron su capacidad para producir el T4SS. “El sistema le otorga una ventaja competitiva a la Xanthomonas”, dice Souza.
Si bien la E. coli no compite con la X. citri en la naturaleza, los investigadores consideran que lo que observaron en el laboratorio puede valer en el campo. Repitieron la prueba con otras cuatro especies de bacterias clasificadas como Gram-negativas, que, al igual que la E. coli, poseen un envoltorio celular integrado por tres capas ‒dos membranas y un periplasma fortificado‒, este último compuesto por un polímero (peptidoglicano) mixto de azúcares y aminoácidos. “Hasta ahora, la Xanthomonas las mató a todas”, relata Farah, quien comenzó a estudiar a la bacteria hace 15 años, cuando formó parte del grupo que secuenció el genoma de la Xanthomonas.
Un ambiente hostil
Farah y su equipo poseen evidencias de que la X. citri se arma con su T4SS especialmente cuando se encuentra en la parte externa de la hoja, un ámbito potencialmente más hostil. “Tal mecanismo ayudaría a la bacteria a tornarse competitiva”, comenta el investigador científico Marcos Antonio Machado, del Centro de Citricultura Sylvio Moreira, en Cordeirópolis. “En términos tecnológicos, dicha comprobación abre la posibilidad de que se busquen compuestos capaces de inhibir el funcionamiento de ese sistema”, dice el investigador, que explora las formas de aumentar la susceptibilidad de la X. citri a compuestos tales como el oxicloruro de cobre, que se emplea para combatir la cancrosis de los cítricos en los naranjales paulistas.
Farah considera que una mejor comprensión del funcionamiento del sistema de secreción IV de la Xanthomonas resulta importante para conocer cómo las bacterias de diferentes especies compiten entre sí cuando se conviven en un mismo ambiente y comparten los mismos recursos. “Esa competencia puede tener implicaciones para la evolución de comportamientos, tanto antagónicos como cooperativos entre distintas especies bacterianas”, comenta. Esos estudios también podrían conducir a la identificación de nuevas toxinas y blancos moleculares para drogas con acción antibacteriana. “Estamos utilizando a la Xanthomonas”, completa Farah, “para comprender las funciones universales de las bacterias”.
Proyecto
Señalización mediante c-di-GMP y el sistema de secreción de macromoléculas del tipo IV en Xanthomonas citri (nº 2011/ 07777-5); Modalidad Proyecto Temático; Investigador responsable Shaker Chuck Farah (IQ-USP); Inversión R$ 2.146.849,71 (FAPESP – para la totalidad del proyecto).
Artículos científicos
SOUZA, D. P. et al. Bacterial killing via a type IV secretion system. Nature Communications. 6 de mar. 2015.
SOUZA, D. P. et al. A component of the Xanthomonadaceae type IV secretion system combines a VirB7 Motif with a no domain found in outer membrane transport proteins. PLOS Pathogens. 2011.
ALEGRIA, M. C. et al. Identification of new protein-protein interactions involving the products of the chromosome and plasmid-encoded type IV secretion loci of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri. Journal of Bacteriology. v. 187, p. 2315-25. 2005.
