CLEBER A. TRUJILLO Y ALEXANDER HENNING ULRICH/IQ-USPTal como una explosión: formación de neuronas, en rojoCLEBER A. TRUJILLO Y ALEXANDER HENNING ULRICH/IQ-USP
La misma molécula que investigadores brasileños presentaron al mundo hace 53 años como un potente regulador de la presión arterial – pues originó toda una serie de medicamentos antihipertensivos – vuelve a sorprender por su versatilidad. Pasadas más de cinco décadas desde su identificación a cargo de los médicos Maurício Rocha e Silva, Wilson Teixeira Beraldo y Gastão Rosenfeld, esta molécula, la bradicinina, un fragmento de proteína (péptido) naturalmente hallado en la sangre y en otros tejidos del cuerpo y liberado en concentraciones más elevadas durante una inflamación, ahora llama la atención debido a unos efectos que no se imaginaba que pudiera tener. Según estudios llevados a cabo durante los últimos años, también a cargo de equipos brasileños, se reveló que la bradicinina propicia que las células madre se transformen en neuronas y las protege de la muerte durante las lesiones cerebrales. Otro trabajo sugiere que en el tejido adiposo la bradicinina regula la liberación de la hormona que induce la saciedad reduciendo la acumulación de grasas. Estos hallazgos, aún sin aplicación clínica, abren nuevos caminos para la comprensión de cómo se forma el cerebro y cómo surgen ciertas enfermedades neurológicas, aparte de la obesidad. Y renuevan la expectativa al respecto de que, quien sabe, en algunos años, surjan formas más eficientes de tratamiento de estos problemas.
La sospecha de que la bradicinina podría hacer algo más que reducir la presión sanguínea y desencadenar inflamaciones localizadas, como respuesta natural del organismo ante las lesiones, surgió a mediados de los años 1990, durante el doctorado del bioquímico Alexander Henning Ulrich en la Universidad de Hamburgo, Alemania. Ulrich investigaba los mecanismos de proliferación de tumores del tejido neuronal y reparó en que la bradicinina activaba ciertos mecanismos de señalización en esas células, siendo su efecto más leve o nulo en otras células. A partir de 2002, como docente en el Instituto de Química de la Universidad de São Paulo (USP), el científico retomó el estudio de esa función de la bradicinina.
El biomédico Antonio Henrique Martins, durante su doctorado en el laboratorio de Ulrich, estudiaba la transformación de células madre (inmaduras) en neuronas – las células cerebrales que almacenan y transmiten información y nos permiten aprender, recordar e incluso pensar al respecto de la capacidad de pensar –, cuando observó un resultado inesperado. Las neuronas cultivadas en uno de los recipientes plásticos permanecían adormecidas incluso después de recibir un baño del neurotransmisor acetilcolina, uno de los mensajeros químicos que usualmente las activan.
Henrique se lo comunicó a Ulrich así: “Debo estar cometiendo algún error. Estas células no responden a la acetilcolina”. Entonces repitieron los ensayos, pero los resultados no se modificaron. Nuevamente surgieron células que se asemejaban a las neuronas, aunque no se comportaban como neuronas, semanas después de que las células madres fueran colocadas en frascos con un caldo de nutrientes que las estimula para asumir funciones específicas durante un proceso conocido como diferenciación celular. Algo estaba interfiriendo en la maduración de las células madre.
Los investigadores revisaron los ingredientes del medio de cultivo de las células. El único componente distinto era un compuesto sintético conocido con el nombre de HOE-140, que inhibe la actividad de la bradicinina, que en aquella época aún no poseía acción conocida sobre el cerebro. En una especie de competencia molecular, aquel compuesto se adhiere a una proteína situada en la superficie de las células, el receptor B2, al cual debería unirse la bradicinina. De esta manera, el HOE-140 impide que la bradicinina interactúe con las células.
Al acoplarse con el receptor B2, la bradicinina activa una cadena de reacciones químicas que modifica el ámbito intracelular. Pequeñas bolsas liberan ión calcio en el citoplasma, la parte gelatinosa de la célula, que envuelve al núcleo. En el citoplasma, las oscilaciones en el índice de calcio – los niveles pueden aumentar entre 10 y 100 veces – funcionan como un código que activa ciertos grupos de genes en el núcleo y define el destino de la célula: continuar multiplicándose y conservar el potencial para originar distintos tipos de células o especializarse en determinada función.
CLEBER A. TRUJILLO Y ALEXANDER HENNING ULRICH/IQ-USPLa bradicinina en acción: a partir de la neuroesfera, en el borde inferior derecho, se forman más neuronas, en rojo…CLEBER A. TRUJILLO Y ALEXANDER HENNING ULRICH/IQ-USP
Henrique y Ulrich prepararon a continuación otra serie de ensayos con la misma familia de células embrionarias de tumor de ratón, capaces de originar fibroblastos, células musculares y de tejido cerebral. Durante ocho días, el tiempo que tardan las células inmaduras para transformarse en neuronas en laboratorio, midieron la cantidad de receptores B2 y la liberación de bradicinina. También compararon el grado de madurez de las células tratadas con bradicinina con el de las que recibieron una combinación de bradicinina y HOE-140, que anula el efecto del péptido identificado en los años 1940 por Rocha e Silva y sus colegas. Finalmente, constataron que: sin bradicinina, la transformación y la maduración no son completas. Las neuronas resultan imperfectas.
Los investigadores observaron que, durante el proceso natural de diferenciación, el número de receptores de la bradicinina aumenta gradualmente. Por otra parte, las células lanzan medio externo parte de la bradicinina producida por ellas mismas, cosa que afecta el funcionamiento de sus vecinas. Como resultado de ello, surgen neuronas sensibles al neurotransmisor acetilcolina, el mensajero químico que transmite la información desde una célula cerebral a otra, tal como se detalla en un artículo publicado en 2005 en Journal of Biological Chemistry. Sin embargo, bajo los efectos del HOE-140, la transformación se detenía. Al finalizar los ensayos, las células no respondían a la acetilcolina ni presentaban las prolongaciones características en las neuronas. “Las neuronas quedaban incompletas y sólo un porcentaje menor de ellas sobrevivía”, dice Henrique, actualmente docente en la Universidad Central del Caribe, en Puerto Rico.
“La bradicinina no inicia la diferenciación celular, pero define el camino que han de seguir para las células”, explica Ulrich, quien llegó a Brasil en 1999 para trabajar en la USP junto al médico Walter Colli, uno de los grandes especialistas mundiales en la enfermedad de Chagas, en la búsqueda de moléculas que pudiesen impedirle al causante de la enfermedad invadir las células de mamíferos.
Para evaluar el efecto de la bradicinina en la diferenciación y la madurez neuronal en otros modelos experimentales, el biólogo Cleber Trujillo, otro estudiante de doctorado bajo la dirección de Ulrich, evaluó células madre extraídas del tejido cerebral de embriones de ratones, con la ayuda de la química Telma Tierni Schwindt y de la bióloga Priscilla Negraes. Cleber colocó células madre aisladas en un medio de cultivo y aguardó que cada una desarrollase las denominadas neuroesferas, unos núcleos con alrededor de 100 mil células progenitoras de los dos tipos de células cerebrales: las neuronas y las células gliales. Luego agregó bradicinina y esperó para ver que ocurría.
“Cuando agregamos bradicinina al medio de cultivo, mayor cantidad de células madre recorren distancias mayores”, comenta Ulrich. Este desplazamiento celular se encuentra directamente relacionado con la formación y maduración de neuronas. Cuanto más se alejan de la neuroesfera, más neuronas se originan, con más ramificaciones, lo cual resulta fundamental para el establecimiento de las conexiones cerebrales.
En presencia de la bradicinina, se forman hasta un 30% más de neuronas que lo normal, y una proporción menor de células gliales o glías. La producción de neuronas creció todavía más cuando Cleber agregó a las células madre en proceso de diferenciación un compuesto denominado captopril. El captopril, el primer medicamento antihipertensivo en actuar de manera indirecta sobre la bradicinina, manteniéndola activa durante más tiempo, fue desarrollado durante los años 1970 por investigadores estadounidenses a partir de una molécula identificada en el veneno de la yarará por el farmacólogo Sérgio Henrique Ferreira, durante su doctorado con Maurício Rocha e Silva en la USP de Ribeirão Preto.
La reorientación del destino celular determinado por la bradicinina fue confirmado en pruebas con ratones transgénicos realizados por el equipo de João Bosco Pesquero, biólogo molecular de la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp). De acuerdo con los datos remitidos para su publicación, las células madre cerebrales de roedores genéticamente alterados para no producir el receptor B2, cuando son aisladas e inducidas a diferenciarse, no originaban una mayor proporción de neuronas.
Como los resultados habían sido obtenidos con ratones, era necesario descubrir lo que sucedería con las células humanas. Cleber se dirigió al laboratorio del investigador brasileño Alysson Muotri en la Universidad de California en San Diego. Ahí aprendió a trabajar con células madre humanas obtenidas a partir de la reprogramación de células de la piel. Una vez más la badicinina indujo a las células madre a transformarse en neuronas.
Alguien podría preguntarse cuál es la ventaja de aumentar en el cerebro la cantidad de neuronas en comparación con las glías. En los organismos sanos, es incluso probable que esa ventaja no exista. Sucede que la alteración de la proporción entre esos dos tipos de células puede afectar la arquitectura cerebral. Y la forma en que las células se hallan dispuestas y conectadas entre sí determina el funcionamiento cerebral; al menos, el funcionamiento actualmente conocido.
En un estudio reciente, los equipos de Roberto Lent y Suzana Herculano-Houzel, de la Universidad Federal de Río de Janeiro, y de Wilson Jacob Filho, de la USP, sugieren que el cerebro humano contiene la misma proporción de neuronas y células gliales. Un humano adulto contaría con alrededor de 86 mil millones de neuronas y 85 mil millones de glías (astrocitos, oligodendrocitos y microglías). Glía es una palabra de origen griego que significa cola. Hasta hace poco tiempo atrás, las células gliales consideradas un mero soporte físico para las neuronas, pero ahora están adquiriendo relevancia, al constatarse de que ejecutan funciones tan importantes como las neuronas: ayudan en la transmisión de los impulsos nerviosos y en la defensa del sistema nervioso central contra los microorganismos invasores.
CLEBER A. TRUJILLO E ALEXANDER HENNING ULRICH/IQ-USP… que células gliales, en verdeCLEBER A. TRUJILLO E ALEXANDER HENNING ULRICH/IQ-USP
Pero la producción de una mayor cantidad de neuronas puede resultar interesante en algunas situaciones, además de ayudar a comprender cierta capacidad que posee el cerebro para recuperarse de lesiones, según consideran los investigadores. Existe la posibilidad de que, al controlar la formación de neuronas a partir de las células madre, sea posible sustituir las células muertas en caso de enfermedades neurodegenerativas, tal como en el caso del mal de Parkinson, o en un caso de isquemia, que es la interrupción del flujo de oxígeno y nutrientes provocada por la obstrucción de los vasos sanguíneos.
“Ya se conoce, por experimentos con animales, que el trasplante en el cerebro de las células ya diferenciadas no funciona, pues las mismas son incapaces de rehacer las conexiones correctas y mueren”, expresa Telma. “Aunque tal vez sea posible implantar células inmaduras e inducirlas a transformarse en neuronas”. Ella y Enéas Ferrazoli actualmente investigan la hipótesis en un modelo de Parkinson en ratones, en colaboración con Beatriz Longo, de la Unifesp. Los resultados iniciales son alentadores.
Quien sufre el mal de Parkinson, comúnmente experimenta temblores, dificultad para la ejecución de movimientos y para mantener la estabilidad corporal, como consecuencia de la muerte de las neuronas en dos regiones cerebrales – la sustancia negra y el núcleo estriado – productoras del neurotransmisor dopamina. Como los roedores no experimentan esos síntomas, Telma se vale de otra estrategia para evaluar la evolución de la enfermedad. Mediante la inyección de compuestos químicos específicos, induce la muerte de las neuronas de la sustancia negra y del cuerpo estriado en un sólo hemisferio cerebral de los roedores. El resultado muestra que, al recibir un compuesto estimulante, los animales comienzan a moverse en círculos.
En una primera prueba, Telma observó que la bradicinina, incluso aplicada luego de la muerte de las neuronas, permitió la recuperación de ambas regiones afectadas. De los cinco animales que formaron parte del experimento, cuatro dejaron de moverse en círculos luego del tratamiento. “Las células madre del cerebro de los animales pueden haber migrado hacia las regiones dañadas diferenciándose como neuronas”, comenta la investigadora.
La reposición celular observada en esos experimentos con animales, sin embargo, no fue el único efecto benéfico de la bradicinina en el sistema nervioso central. Recientes pruebas realizadas por Henrique y la biomédica Janaina Alves, alumna de doctorado de Ulrich, indican que la bradicinina puede evitar la muerte de las neuronas por isquemia. En un modelo que reproduce los daños causados por esa afección, Henrique y Janaina trataron una región del cerebro de ratones con N-metil-D-aspartato. Este compuesto, más conocido como NMDA, provoca que un torrente de calcio invada las células – los índices llegan a ser mil veces superiores a lo normal –, matándolas. La medición de la actividad neuronal reveló que un 80% de las células del hipocampo murieron luego de la administración de NMDA. La tasa de muerte celular, empero, descendió hasta un valor del 20% cuando el hipocampo, además del NMDA, recibió bradicinina, según un artículo enviado recientemente para su publicación en una revista científica.
En la Universidad Central del Caribe, en colaboración con los neurocientíficos Pedro Ferchmin y Vesna Eterovic, junto con la estudiante Wilmare Torres, Henrique verificó que la bradicinina evita la muerte de las neuronas expuestas a la acción de un compuesto que provoca los mismos efectos del gas sarín, desarrollado por Alemania durante la Segunda Guerra Mundial y utilizado en un atentado terrorista en 1995 en Tokio. Los compuestos que intentan atenuar los efectos de esas armas químicas no resultan totalmente eficaces. “Soldados que combatieron en la Guerra del Golfo y fueron expuestos a armas químicas recibieron un antídoto y sobrevivieron, pero ahora presentan problemas de memoria”, dice Henrique.
Janaina, Ulrich y él proponen una nueva explicación para el efecto neuroprotector de la bradicinina. Ésta impediría la muerte de las células vía glutamato, un neurotransmisor que resulta tóxico en dosis elevadas, y no sólo por mejorar la provisión de oxígeno y nutrientes al provocar vasodilatación, tal como se creía. Según Henrique, los experimentos indican que la bradicinina activa proteínas que evitan la muerte celular.
Mediante un mecanismo distinto, Pesquero, de la Unifesp, comprobó que la bradicinina influye en el consumo de energía por parte del organismo. “Identificamos un efecto directo de la bradicinina en el metabolismo energético”, comenta. Años atrás, Pesquero observó que ratones transgénicos que él había producido durante una pasantía en el Instituto Max Delbrück, en Alemania, engordaban menos que los ratones normales sometidos a una dieta altamente calórica. La diferencia entre ambos grupos de roedores es que los transgénicos no presentaban en sus células el receptor B1, al cual se une un subproducto de la bradicinina y activa fenómenos típicos de las inflamaciones.
Los animales sin el receptor B1 eran más sensibles a la hormona leptina, según reflejaron pruebas realizadas por el biomédico Marcelo Mori y el médico veterinario Ronaldo da Silva Araújo, ambos del equipo de Pesquero y actualmente docente de la Unifesp, publicados en 2008 en la revista Diabetes. Esa hormona, secretada por el tejido adiposo, induce la saciedad y hace que aumente el consumo de energía del organismo. Según Pesquero, la eliminación del receptor B1 aparentemente induce a las células a producir mayor cantidad de receptores B2, a los cuales se une la bradicinina. “Esto sugiere que la misma regula la sensibilidad a la leptina”, comenta el investigador.
Él verificó, en ratones transgénicos, que la producción de B1 solamente en el tejido adiposo resulta suficiente para hacerlos engordar como a los animales comunes. Pesquero considera que es posible obtener un compuesto que bloquee la actividad del receptor B1 y ayude en el control de la obesidad. Probó con una molécula antagonista del receptor B1, que una empresa farmacéutica se encontraba desarrollando con el objetivo combatir el dolor asociado con la inflamación. La molécula se reveló eficiente para controlar el aumento de peso de los animales, pero la empresa la descartó debido a los efectos colaterales indeseables.
Pese a los prometedores resultados, aún resulta poco probable que algún día la bradicinina se utilice en el tratamiento de isquemias u obesidad. Aunque su versión sintética existe desde hace casi medio siglo, no ha sido aprobada para su utilización en humanos. Algunos estudios sugieren que la administración de bradicinina provoca efectos indeseables graves, tales como edema cerebral o disminución importante de la presión arterial. “Cultivada in vitro, la bradicinina mostró actividad neuroprotectora, pero in vivo la cosa se complica, ya que ocurren muchas interacciones que no siempre son previsibles”, comenta Henrique. La esperanza reside en la obtención de una molécula análoga a la bradicinina que provoque menos efectos colaterales y también resulte neuroprotectora. Por ahora, recuerda Cleber Trujillo, “la comprensión de cómo actúa en el tejido adiposo y en el sistema nervioso central es de por sí bastante significativa”.
Los proyectos
1. Modulado artificial de la diferenciación neuronal y función de los receptores por oligonucleótidos sintéticos actuantes en los niveles génico y proteico (no 2001/ 08827-4); Modalidad Joven Investigador; Coordinador Alexander Henning Ulrich – IQ/USP; Inversión R$ 1.419.510,07 (FAPESP)
2. Bases moleculares para la diferenciación de células madre y progenitoras neuronales (no 2006/ 61285-9); Modalidad Proyecto temático; Coordinador Alexander Henning Ulrich – IQ/USP; Inversión R$ 1.038.469,28 (FAPESP)
3. Doble trasplante de microesferas y células madre neuronales como terapia para el mal de Parkinson (no 2009/50540-6); Modalidad Joven Investigador; Coordinador Telma Tiemi Schwindt – IQ/USP; Inversión R$ 193.442,57 (FAPESP)
Artículos científicos
MARTINS, A. H. et al.Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Carcinoma Cells Modulates Kinin B2 Receptor Gene Expression and Function.Journal of Biological Chemistry.v. 280, p. 1.9576-86. 20 may. 2005.
MORI, M.A. et al. Kinin B1 receptor deficiency leads to leptin hypersensitivity and resistance to obesity. Diabetes. v. 57, p. 1.491-1.500. Jun. 2008.
