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La tijera de los genes

Mediante pruebas en seres humanos, se evalúa la seguridad de una técnica de recorte y edición del ADN para el tratamiento de enfermedades

Zé Vicente

La técnica de edición génica a la cual se la conoce por la sigla CRISPR-Cas9, considerada revolucionaria, comienza a tornar más próxima a la realidad la alteración o sustitución de genes para tratar o evitar enfermedades. El resultado de su primer uso en seres humanos fue descrito en septiembre de 2019 en un artículo que salió publicado en la revista New England Journal of Medicine. En ese trabajo, el inmunólogo Deng Hongkui y su equipo en la Universidad de Pekín, en China, relataron un test pionero aplicado a un individuo de sexo masculino de 27 años que padecía leucemia, un tipo de cáncer causado por la proliferación de células de defensa inmaduras, que además era portador de VIH, el virus del sida. Luego de controlar esas enfermedades con medicamentos, en 2017, los investigadores sometieron al paciente a un tratamiento innovador. Tanto la leucemia como la infección por VIH afectan a las mismas células inmunitarias, los linfocitos, que atacan a los organismos invasores y a las células enfermas. Como la solución implicaba restaurar la producción de linfocitos saludables, los médicos decidieron combatir ambos problemas con un trasplante especial. Extrajeron células de la médula ósea de un donante y, antes de transferirlas al paciente, se valieron de la técnica CRISPR para desactivar el gen que contiene la fórmula de una proteína que el VIH utiliza para invadir a los linfocitos. De esa manera, esperaban restablecer la producción de células defensivas sanas e inmunes al virus, tal como ya había ocurrido con Timothy Ray Brown, conocido como el paciente de Berlín, luego de recibir la médula de un donante que naturalmente no producía esa proteína.

El éxito fue parcial. Los científicos trasplantaron una mezcla de células editadas y no editadas (no fue posible modificarlas a todas). Un año y medio después, la leucemia seguía en remisión y la nueva médula continuaba produciendo linfocitos sanos, aunque solo el 5% de ellos exhibía la alteración protectora. “El test fue concebido para evaluar la seguridad y viabilidad del trasplante”, sostuvo Deng en una comunicación vía e-mail con Pesquisa FAPESP. El experimento funcionó como prueba de principio e indicó que la realización del procedimiento es factible y aparentemente no causa daños. No obstante, antes de evaluar la eficacia de la estrategia para doblegar a la infección por VIH, será necesario elevar la eficiencia de la edición y perfeccionar el protocolo de trasplante. Lo ideal es que todos los linfocitos se tornen inmunes al virus. “Resolvimos dedicarnos a mejorar la técnica antes de tratar a otros pacientes”, relató el inmunólogo.

La técnica CRISPR no es la primera ni la única forma de modificar o desactivar genes testeada en seres humanos. La idea de que era posible recortar el material genético de las células en puntos específicos y alterarlo –insertando un nuevo gen o desactivando otro con actividad indeseada– surgió a partir del hallazgo de un sistema de defensa de las bacterias. En los años 1960, los científicos estadounidenses Hamilton Smith y Daniel Nathans (1928-1999) junto al suizo Werner Arber, identificaron en esos organismos unas proteínas denominadas nucleasas, que funcionan como tijeras moleculares y cortan el material genético (ADN) de los virus invasores en puntos específicos. Ese descubrimiento le valió al trío el Premio Nobel de Medicina de 1978 y condujo al desarrollo de estrategias para modificar el ADN de las células.

Dos técnicas propuestas en las décadas de 1990 y 2000 se basaban en ese principio: la edición con nucleasas con dedos de zinc (zinc finger nucleases, o ZFN) y con nucleasas efectoras del tipo activador de transcripción (transcription activator-like effector nucleases, o TALEN). Ambas utilizan una proteína artificial, formada por la unión de otras dos: una que reconoce el segmento del material genético y otra que lo recorta. Las mismas funcionan de manera precisa y se las está evaluando en animales y en seres humanos. Hay en curso una docena de ensayos clínicos con la ZFN y la mitad de esa cantidad con la TALEN (lea el reportaje en la página 20). Empero, existe un problema. Las proteínas son moléculas grandes, complejas y resulta difícil producirlas en laboratorio. Otra complicación radica en que se necesita diseñar una nueva proteína para cada tramo apuntado del ADN.

En eso la CRISPR lleva una ventaja. Ella también utiliza una molécula híbrida, pero en este caso está formada por una proteína (la Cas) y un ARN, que es bastante menor y más simple de diseñar en laboratorio (vea la infografía arriba). En 2012, la bioquímica estadounidense Jennifer Doudna, de la Universidad de California en Berkeley, Estados Unidos, y la genetista francesa Emmanuelle Charpentier, que en la actualidad trabaja en el Instituto Max Planck, en Alemania, crearon una versión simplificada del sistema CRISPR-Cas y demostraron que la misma funcionaba en pruebas con ADN. Al año siguiente, el bioquímico chinoestadounidense Feng Zhang, del Instituto Broad, en Estados Unidos, empleó esa estrategia para manipular el ADN de células humanas. Esos resultados, que salieron publicados en la revista Science, fueron el punto de partida de una carrera mundial para dominar la técnica, así como una disputa por los derechos de propiedad intelectual entre Berkeley y el Broad (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 269).

“La producción de secuencias cortas de ARN en laboratorio es algo trivial y barato, lo que convierte a la CRISPR en una técnica más versátil y accesible que cualquier otro método de edición génica”, dice el genetista Carlos Menck, de la Universidad de São Paulo (USP). En colaboración con la investigadora Clarissa Rocha, de la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp), él utiliza la CRISPR para identificar a los genes que confieren resistencia a los medicamentos a las células tumorales.

A causa de esa simplicidad y de su versatilidad, en poco tiempo, investigadores de todo el mundo comenzaron a testear la CRISPR en plantas y animales con los objetivos más dispares, desde perfeccionar la producción de alimentos hasta la creación de modelos para el estudio de enfermedades humanas. Ratones, ratas, conejos, cerdos, perros y monos ya han sido alterados genéticamente mediante la técnica CRISPR, muchos de ellos en forma pionera por científicos chinos. Menos de cinco años después de la publicación de los artículos en la Science, aparecieron trabajos que demuestran que es posible corregir genes defectuosos en embriones humanos y comenzaron los tratamientos experimentales en humanos.

Los ensayos en humanos
Más allá del caso tratado en China, el primer test en humanos con sus datos consignados en una publicación científica, se informó de otros cinco más recientes. Al comienzo del pasado mes de noviembre, el equipo del médico Edward Stadtmauer, de la Universidad de Pensilvania, en Estados Unidos, presentó los datos iniciales del uso de células inmunitarias que, por medio de la técnica CRISPR, recibieron un gen que las guiaba para acometer a dos tipos de tumores (mieloma múltiple y sarcoma) y simultáneamente se había inhibido a otros que frenan la acción de esas células. Seis meses después del tratamiento, los pacientes no evidenciaron efectos colaterales graves. Una mujer con mieloma había mejorado y se había detenido el avance del sarcoma del segundo paciente. Del tercero no había resultados, informaron los investigadores en la reunión anual de la Sociedad Americana de Hematología de 2019.

También en el mes de noviembre, la empresa farmacéutica estadounidense Vertex Pharmaceuticals y la suiza CRISPR Therapeutics anunciaron el éxito inicial de la técnica CRISPR para el tratamiento de una paciente con talasemia beta y otra con anemia falciforme, enfermedades genéticas que inducen la producción de una forma alterada de hemoglobina, la proteína que transporta el oxígeno en la sangre. Ellas forman parte de unos ensayos clínicos en los cuales 45 participantes reciben célula de su propia médula editadas para el tratamiento de la enfermedad. Meses después de esa terapia, la paciente con talasemia beta ya no necesitaba transfusiones de sangre y la mujer con anemia falciforme ya no presentaba lesiones en los órganos provocadas por el bloqueo de los vasos sanguíneos, como consecuencia de la acumulación de hematíes deformes. “Estos datos afianzan nuestra creencia de que estas terapias podrán aportar un beneficio significativo a los pacientes luego de una única intervención”, dijo en ese entonces Samarth Kulkarni, el presidente de CRISPR Therapeutics, en un comunicado a la prensa.

En ese tratamiento, los investigadores usaron la técnica CRISPR para introducir una anomalía en el gen BLC11A y desactivarlo. De esa manera, reactivaron la producción de hemoglobina fetal, que se sintetiza durante la vida intrauterina. Incluso en una cantidad moderada, la hemoglobina fetal reduce el efecto nocivo de la hemoglobina defectuosa. En Brasil, el equipo del hematólogo Fernando Costa, de la Universidad de Campinas (Unicamp), intenta reproducir ese tratamiento introduciendo una modificación. En lugar de inducir en el BLC11A mutaciones desconocidas, tal como hicieron las empresas, él y la bióloga Priscila Martin optaron por utilizar una alteración ya identificada en la década de 1980 en la población brasileña. Esa mutación incrementa la producción de hemoglobina fetal en la vida adulta sin afectar otros genes. Costa y Martin ya introdujeron esa alteración en linajes de células humanas, las cuales comenzaron a producir hemoglobina fetal en mayor cantidad. El grupo está repitiendo el procedimiento en ratones con anemia falciforme. “Si la cantidad de hemoglobina fetal llega a niveles cercanos a un 25% del total de la hemoglobina, puede que dejen de producirse lesiones por obstrucción en lo vasos sanguíneos”, comenta Costa.

Al comienzo de este año estaban en curso 16 ensayos clínicos, entre ellos, los dos de Vertex y de CRISPR Therapeutics. Se trata de test iniciales, destinados a evaluar la seguridad y, hasta cierto punto, la eficiencia de la edición génica mediante la técnica CRISPR. La mayor parte de ellos (11) utiliza la técnica para alterar el funcionamiento de las células inmunológicas y liberarlas para que ataquen a diversos tipos de cáncer (linfoma, leucemia, esófago, estómago y pulmón). Los restantes intentan morigerar o corregir los daños causados por enfermedades hereditarias causadas por un gen defectuoso, tal como ocurre en los casos de la talasemia beta y la anemia falciforme.

Diez de esos test están en curso en hospitales e institutos de investigación de China y cinco en instituciones estadounidenses. Esa cifra marca un avance en la capacidad del gigante asiático para producir ciencia en el campo de la biotecnología y la medicina, tan es así que ya hay expertos diciendo, acaso con exageración, que la disputa entre estadounidenses y chinos sería similar a la que se dio entre Estados Unidos y la Unión Soviética durante la Guerra Fría. Desde 2013 en adelante, las publicaciones sobre la CRISPR aumentaron 100 veces. Pubmed, la mayor base mundial de artículos y libros del área médica, tenía registrados en aquel año 29 artículos sobre CRISPR-Cas9, y 3.221 para 2019. De los 9.700 trabajos publicados entre 2013 y 2019, un 27% tiene un autor chino y un 29%, al menos un estadounidense.

A pesar del incremento de las investigaciones, todavía es pronto para saber si esa técnica funcionará en seres humanos. Por el momento, solo se conocen los datos preliminares de cinco o seis casos informados. El único test con humanos finalizado involucró a 16 pacientes con cáncer de esófago y se llevó a cabo en el Hospital del Cáncer de Hangzhou, en China. Sin embargo, los resultados no fueron divulgados. De cualquier modo, algunos dicen que en pocos años la CRISPR hará realidad la terapia génica.

“Esta técnica ya se está empleando para tratar enfermedades en pacientes humanos. No se trata de un escenario hipotético”, sostiene el biólogo molecular Graham Dellaire, de la Universidad Dalhousie, en Canadá, quien estudia los mecanismos de combate contra las células tumorales y la técnica CRISPR. En los últimos años, junto a otros colaboradores, escribieron comentarios acerca de las cuestiones éticas relacionadas con la edición génica, que se tornaron más acuciantes desde que el biofísico chino He Jiankui declaró, en noviembre de 2018, que había creado a los primeros bebés editados mediante CRISPR (lea en la página 19). En diciembre de 2019 fue sentenciado a tres años de prisión, acusado de práctica médica ilegal.

Los primeros pasos
En Brasil, grupos del área de la salud están testeando la CRISPR con diferentes propósitos, desde el tratamiento del cáncer hasta el combate de parásitos tales como el Trypanosoma cruzi, causante del mal de Chagas. Los resultados más avanzados son los del fisiólogo Guilherme Baldo, de la Universidad Federal de Rio Grande do Sul (UFRGS). En el Centro de Terapia Génica del Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Baldo y su grupo utilizaron la técnica para desarrollar un tratamiento experimental para la mucopolisacaridosis, un trastorno genético raro que afecta a una de cada 100 mil personas y daña varios órganos, aparte de perjudicar el desarrollo cerebral.

Ciertas alteraciones en el gen de la enzima alfa-L-iduronidasa propician la acumulación de los azúcares denominados mucopolisacáridos, que son tóxicos para las células. El tratamiento más eficaz es el trasplante de médula ósea, que exige la destrucción del sistema inmunológico y debe realizarse antes de los 2 años de edad para disminuir el riesgo de deficiencia intelectual. Una alternativa es la reposición de la enzima, algo que no impide los daños neurológicos y puede costar hasta 1 millón de reales por año.

Mediante el uso de la CRISPR, los investigadores gaúchos han corregido esa alteración en cultivos de células humanas y en ratones. El tratamiento restauró la función del gen en el 4% de las células del pulmón y del corazón. Un mes más tarde, los animales ya producían de un 7% a un 6% de la cantidad de enzima sintetizada por un organismo sano, según consta en un artículo que salió publicado en 2018 en la revista Journal of Controlled Release. “Aunque la eficiencia aún es baja, es probable que la cantidad ya sea suficiente como para evitar la progresión de la enfermedad. Los niños que sintetizan hasta un 2% de la enzima no presentan deficiencia intelectual”, comenta Baldo. Él busca una forma de elevar la disponibilidad de la enzima en el cerebro y planea nuevos experimentos con animales antes de que el tratamiento se muestre seguro como para evaluárselo en humanos.

Xenotrasplante
La CRISPR también puede colaborar para suplir la falta de órganos para trasplantes. Una de las fuentes posibles son los cerdos, cuyos órganos presentan dimensiones similares a las de los seres humanos, Para que el trasplante entre especies distintas (xenotrasplante o trasplante heterólogo) se torné una realidad, se necesita eliminar el riesgo de transmisión de enfermedades y de rechazo. En 2015, el genetista George Church, de la Universidad Harvard, neutralizó 62 retrovirus del genoma porcino que podrían causar problemas a los seres humanos, una tarea inimaginable entes de que existiera la técnica CRISPR.

En el Centro de Investigaciones sobre el Genoma Humano y Células Madre (CEGH-CEL) de la USP, un equipo coordinado por el cirujano Silvano Raia y por la genetista Mayana Zatz trabaja para desactivar los tres genes principales que activan el sistema inmunitario del huésped, provocando el rechazo del órgano trasplantado. El biólogo Luiz Caires y otros miembros del grupo ya bloquearon [knockout] uno de esos genes en células de fetos porcinos. “La eficiencia aún es baja, pero estamos perfeccionando la técnica”, afirma. Ellos esperan obtener células con los tres genes suprimidos para el mes de septiembre.

El paso siguiente consistirá en extraer el ADN de esas células y transferirlo a un óvulo cuyo núcleo fue vaciado. “Los óvulos se implantarán en hembras para generar animales genéticamente modificados”, relata Zatz. Una vez trasplantado en el abdomen, el riñón porcino genéticamente modificado puede sacar de la hemodiálisis a pacientes que aguardan para recibir un riñón de otra persona (trasplante homólogo o alotrasplante). “En Brasil, 126 mil pacientes se encuentran en lista de espera para un trasplante de riñón y realizan hemodiálisis, un procedimiento que le cuesta al sistema de salud pública 2.800 millones de reales por año”, comenta Raia, el primer médico del mundo que realizó un trasplante de hígado con donante vivo.

En otro laboratorio del CEGH-CEL-USP, la genetista Maria Rita Passos Bueno y su equipo utilizan la CRISPR para estudiar las causas de la hendidura labio palatina [labio leporino]. Se sabe que ciertas alteraciones en casi una docena de genes pueden provocar ese defecto congénito que impide el desarrollo completo del rostro. Sin embargo, existen casos en los cuales los genes están completos y el bebé nace con el labio hendido. En una pasantía supervisada por Passos Bueno, el biólogo Lucas Alvizi empleó una versión de la CRISPR para identificar una posible nueva causa de este problema. En test llevados a cabo con peces cebra (Danio rerio), el grupo constató que el defecto congénito puede ser el resultado de una hiperactivación del gen MIR152. Ese efecto, según se describe en un artículo que los investigadores archivaron en el repositorio BiorXiv, podría producirse a causa de una escasa oxigenación durante la gestación.

En el campus de Ribeirão Preto de la USP, en el interior del estado de São Paulo, los equipos del biólogo molecular Geraldo Aleixo Passos y del inmunólogo Eduardo Donadi emplean la CRISPR con una estrategia diferente. En lugar de corregir alteraciones en un gen, ellos las provocan. El objetivo consiste en conocer de qué manera los defectos que inactivan al gen regulador autoinmune (AIRE, por sus sus sigla en inglés) conducen al desarrollo de enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes tipo 1.

En el organismo de los mamíferos, ese gen es más activo en el timo, una glándula ubicada en el tórax que elimina células inmunitarias (los linfocitos T inmaduros) capaces de atacar al propio cuerpo. Al generar mutaciones que inhibieron el AIRE, los científicos notaron que las células del timo modificaron el perfil de activación de los genes y dejaron de interactuar físicamente con los linfocitos inmaduros, lo que dificulta la eliminación de aquellos que podrían acometer al propio organismo, según relataron en 2018 en la revista Frontiers in Immunology. “La técnica de la CRISPR”, dice Passos, “nos está ayudando a comprender mejor de qué manera colabora el funcionamiento del gen AIRE en la prevención de enfermedades autoinmunes”.

La construcción de una herramienta
En menos de 30 años, el sistema de defensa de las bacterias es adaptado para manipular genes humanos

1987
Yoshizumi Ishino y otros científicos de la Universidad de Osaka, en Japón, identifican en el genoma de las bacterias Escherichia coli las secuencias de ADN repetidas, en la actualidad denominadas CRISPR, las siglas en inglés de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas

1993
Francisco Mojica y colaboradores de la Universidad de Alicante, en España, encontraron secuencias CRISPR en el genoma de la arquea Haloferax mediterranei. Posteriormente se detectan secuencias CRISPR en el genoma de otras bacterias y arqueas, lo que sugiere que cumplirían un rol evolutivo

2002
En la Universidad de Utrecht, Holanda, Ruud Jansen y su equipo identifican genes adyacentes a las secuencias CRISPR, los Cas (Crispr associated). Esos genes codifican proteínas que actúan con la CRISPR

2005
Casi en forma simultánea, los equipos de Mojica, en España, de Christine Pourcel, en la Universidad de París, y de Alexander Bolotin, del Instituto Nacional de Investigación Agronómica, ambos en Francia, notan que los segmentos de ADN entre las secuencias CRISPR son similares a los de los virus que atacan a las bacterias. Eso indica que la CRISPR sería un sistema de defensa contra los virus. En la bacteria Streptococcus thermophilus, Bolotin identifica el gen Cas9, que codifica una proteína que corta las dos hebras del ADN en un tramo específico

2007
Philippe Horvath y otros investigadores de la industria de alimentos Danisco demuestran que la CRISPR forma parte del sistema de defensa de las bacterias. Ella integra el material genético de los virus al de la bacteria y funciona como una memoria del invasor

2008
John van der Oost y su equipo en la Universidad de Wageningen, en Holanda, revelan que los tramos que separan las secuencias CRISPR generan una pequeña molécula de ARN, material genético de cadena simple, que guía a la proteína Cas hasta el material genético invasor. En la Universidad Northwestern, en Estados Unidos, Luciano Marraffini y Erik Sontheimer descubren que el blanco del ARN es el ADN del invasor

2010
El microbiólogo Sylvain Moineau y su equipo, en la Universidad de Laval, en Canadá, verifican que el sistema CRISPR-Cas9 corta las dos cintas del ADN en un punto específico

2011
Por entonces en la Universidad de Umea, en Suecia, la genetista francesa Emmanuelle Charpentier verifica que el ARN que guía a la proteína Cas9 hasta el blanco es de doble cadena, formado por dos moléculas de ARN. En la Universidad de Vilnius, en Lituania, el grupo de Virginijus Siksnys copia el tramo del ADN del Streptoccocus thermophilus que codifica al sistema CRISPR-Cas y lo inserta en el genoma de la bacteria Escherichia coli. El sistema continúa activo y destruye el ADN de los virus invasores

2012
El grupo de Siksnys describe el funcionamiento de la Cas9 y muestra que el ARN guía puede manipularse para dirigir a la Cas9 contra objetivos previamente seleccionados. En colaboración con Jennifer Doudna, de la Universidad de California en Berkeley, Estados Unidos, Charpentier, ahora en el Instituto Max Planck, en Alemania, arriba a resultados similares a los de Siksnys. Los grupos de Doudna y Charpentier también demuestran que es posible crear un ARN sintético de cinta única para guiar a la Cas9, simplificando el método. En mayo, el grupo da California deposita un pedido de patente en Estados Unidos para el uso de la CRISPR-Cas9 para editar genomas. En diciembre, Feng Zhang, del Instituto Broad, y George Church, de la Universidad Harvard, también solicitan la patente de la técnica, iniciando una disputa que aún no se ha resuelto

2013
Feng Zhang adaptó la CRISPR-Cas9 para editar el genoma de mamíferos y la testeó en células humanas

2014
En la Universidad Médica de Nanjing, en China, el equipo de Jiahao Sha produce monos con genes editados por la CRISPR

2015
En un avance en pos de la obtención de órganos porcinos para su trasplante en humanos, Church y su equipo en Harvard desactivan 62 retrovirus del genoma de los cerdos

2016
En la Universidad de Sichuan, en China, You Lu y su equipo prueban el sistema CRISPR-Cas en humanos: desactivan un gen para estimular a las células inmunitarias a combatir el cáncer de pulmón

2017
Ha Youn Shin y colaboradores en los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos identifican alteraciones causadas por la CRISPR fuera del blanco. En la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón, en Estados Unidos, Shoukhrat Mitalipov y su equipo aplican la técnica para corregir en embriones humanos una mutación que causa enfermedad cardíaca

2018
He Jiankui, de la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur, en China, anuncia que obtuvo los primeros bebés humanos con el genoma alterado utilizando la CRISPR. Fue destituido de su cargo en la universidad y en diciembre de 2019 fue condenado a tres años de cárcel

Fuentes Broad Institute; Yshino, I., et al. Journal of Bacteriology. 2018; Nature Biotechnology. 2019.

Proyectos
1. Producción brasileña de porcinos genéticamente modificados destinados al xenotrasplante de órganos humanos (nº 18/14275-5); Modalidad Asociación para la Innovación Tecnológica (Pite); Investigador responsable Silvano Mario Attilio Raia (USP); Inversión R$ 3.748.623,36
2. CEGH-CEL – Centro de Estudios del Genoma Humano y de Células Madre (nº 13/08028-1); Modalidad Centros de Investigación, Innovación y Difusión (Cepid); Investigadora responsable Mayana Zatz (USP); Inversión R$ 43.461.955,95

El resto de los proyectos y los artículos mencionados figuran en una lista en la versión online.

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