EDUARDO CESARRepresentación de la molécula del ADN: la materia prima para la fabricación de reactivos y proteínas recombinantesEDUARDO CESAR
Si las próximas etapas del estudio conducido por la bióloga molecular Dulce Elena Casarini ocurrieran tal como están programadas, se pondrá en venta el próximo año el primer kit para el diagnóstico preventivo de la hipertensión realizado a partir de un análisis de orina. La concreción del método, no invasivo, constituye el corolario de un trabajo que comenzó hace más de 10 años, cuando Casarini, profesora del grupo de Nefrología de la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp), identificó una nueva forma de la enzima conversora de angiotensina I (ECA) que funciona como marcador biológico de la presión alta. Sus estudios revelaron que los animales hipertensos, o con predisposición para desarrollar hipertensión, secretan en la orina la ECA con peso molecular de 90 kDa (kilodáltons, la unidad de masa atómica). El kit está siendo desarrollado conjuntamente con Proteobras, una empresa de biotecnología con sede en Paulínia, en el interior de São Paulo, dirigida por el ingeniero Paulo Roberto Pesquero y por los hermanos biólogos moleculares, en el consejo científico, profesores João Bosco Pesquero, de la Unifesp, y Jorge Luiz Pesquero, de la Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG).
La empresa obtuvo el año pasado una financiación por valor 280 mil reales en el marco de un proyecto del Programa Investigación Innovadora en Pequeñas Empresas (Pipe) de la FAPESP, para desarrollar tres proteínas recombinantes – producidas a partir de genes clonados – y sus respectivos anticuerpos para utilizar en el kit. La expectativa de Pesquero apunta a que el kit pueda contribuir para su utilización en programas de políticas públicas. “Una persona que posea el marcador de hipertensión podrá recibir orientaciones tendientes a mejorar su calidad de vida, adoptando una alimentación adecuada, realizando ejercicios y absteniéndose de fumar y beber”, afirma Dulce. Según ella, un grupo de 1.150 voluntarios con y sin historial de hipertensión en sus familias forman parte de la primera etapa de la investigación, y los resultados obtenidos en 2001 (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 69) mostraron la eficiencia del kit al revelar el riesgo en personas con historial familiar de la enfermedad y que presentaban una ECA con peso molecular 90 kDa en la orina. “Estamos concluyendo la segunda fase de este estudio en el cual los mismos pacientes son evaluados para saber cuáles son los que presentaban el marcador molecular y se tornaron hipertensos”.
El kit estará compuesto por una proteína y su respectivo anticuerpo, capaz de reconocer la presencia del marcador biológico de la hipertensión, y podrá utilizarse para el diagnóstico preventivo de las lesiones renales, principalmente aquéllas que ocurren en los túmulos renales, unas estructuras microscópicas que integran el sistema de filtrado de los riñones. Ese diagnóstico, según Dulce, resulta “importantísimo” para el paciente diabético, y ayudará a los médicos en el tratamiento precoz del riñón, para que el individuo no desarrolle la denominada neuropatía diabética, que puede conducir a la insuficiencia renal. “Esta nueva función para nuestro kit es el resultado de un trabajo concluido recientemente y cuyos resultados nos han sorprendido”, dice la bióloga. Ya se depositó una patente sobre el kit en Estados Unidos y en los principales países europeos, y también, a partir de 2001, en el Instituto Nacional de la Propiedad Intelectual (INPI).
En los laboratorios de Proteobras, cuya facturación anual es de 200 mil reales, mediante la producción de reactivos de rutina para los laboratorios que trabajan con proteínas y ADN, el desarrollo del kit de diagnóstico se encuentra en una etapa avanzada. “Nuestro objetivo consiste en producir una molécula que reconozca a esa enzima conversora de angiotensina I, tal como si fuera un anticuerpo. Pero, para desarrollar esa molécula – que es una proteína recombinante – es necesario antes contar con grandes cantidades de la enzima. Ese material se produce en laboratorio mediante técnicas de clonación”, afirma João Bosco. “Ya hemos clonado la enzima conversora y ahora nos encontramos en fase de expresión y purificación. Luego iniciaremos la producción de los anticuerpos para su uso en el kit”.
EDUARDO CESARPrototipo del kit compuesto con proteína recombinante que funciona como marcador de la hipertensiónEDUARDO CESAR
Insumos innovadores
El desarrollo del kit de diagnóstico para la hipertensión es uno de los proyectos de Proteobras, una empresa creada en 2004, en Mogi das Cruzes (São Paulo), para abastecer al mercado brasileño con proteínas recombinantes de interés socioeconómico y comercial, y que, hasta ese entonces, sólo llegaban importadas. Pasados siete años, ese mercado aún es incipiente en el país y pocas empresas nacionales dominan la tecnología de producción. A nivel mundial, el negocio relacionado con los reactivos, que abarca a las investigaciones con proteínas, ADN y biología celular, totaliza 42 mil millones de dólares anuales y llegará a unos 81 mil millones en 2016, según un estudio publicado en abril de este año por la empresa estadounidense BCC Research de investigación de mercado.
“Brasil representa un mercado enorme, aunque reprimido. Resulta complicado establecer su tamaño, ya que todas las áreas del conocimiento, sectores de la economía y actividades que involucran a humanos y otros animales pueden hacer uso de estos productos”, dice João Bosco. Las proteínas recombinantes cuentan con aplicaciones en los campos de la salud, biología, bioquímica, biotecnología, microbiología y agricultura, entre otros. Los laboratorios de análisis clínicos utilizan este material en diversos exámenes y tratamientos de ciertas enfermedades genéticas, tales como las enfermedades relacionadas con el proceso de coagulación en hemofílicos y errores innatos del metabolismo. “Otro factor que limita el uso de recombinantes es la dificultad de obtención y purificación de la proteína. El proceso presenta varias etapas y un elevado grado de dificultad”, dice João Bosco. Para él, “el país cuenta actualmente con una cantidad muy pequeño de profesionales experimentados en técnicas que involucran proteínas, lo cual dificulta el avance en el sector”.
Proteobras ya domina el proceso de producción, que comienza con la definición de la proteína de interés que se pretende producir. El primer paso es el aislamiento del ADN que se empleará y que puede extraerse de la sangre o de la saliva de un individuo que posea la proteína. Luego, es necesario multiplicar el número de copias de este ADN – un proceso denominado por los científicos como amplificación – mediante el uso de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, su sigla en inglés). Una vez hecho esto, puede comenzarse con el clonado del ADN, que es injertado en un vector de clonado o expresión, originando un vector recombinante. El vector es una especie de matriz molecular que sirve como soporte para el ADN de interés. Ese vector recombinante se inserta dentro de un organismo – una bacteria, una levadura, una célula de mamífero, de insecto o de una planta –, que funcionará como un birreactor, donde la proteína será producida, o expresada, en la jerga científica. La elección del organismo depende de factores tales como la cantidad, el costo, el tipo de molécula que se desea clonar y su aplicación. A continuación, el organismo es colocado en una placa con antibiótico, que matará a aquéllos que no incorporen el ADN, dejando solamente a los organismos positivos, resistentes al antibiótico. Ésta constituye la etapa de selección. Los clones positivos son aislados y multiplicados en un medio de cultivo. Al final del proceso, el organismo expele la proteína y los científicos proceden a la purificación de la sustancia. “Ésa es la parte más importante del proceso, que puede realizarse separando la proteína por tamaño o por carga eléctrica, entre otros métodos”, explica el profesor de la Unifesp.
Además de las moléculas todavía en fase de desarrollo, Proteobras comenzará a comercializar en noviembre dos nuevos productos para la comunidad científica: una polimerasa de ADN y un patrón de masa molecular del ADN. La polimerasa es una enzima con interés biotecnológico por sus aplicaciones en diagnósticos, utilizada tanto en el proceso de amplificación del ADN – durante la producción de proteínas recombinantes –, por ejemplo, como en los test de paternidad y otros exámenes moleculares realizados por laboratorios de análisis clínicos y hospitales. El patrón de masa muscular también se emplea para el desarrollo de proteínas recombinantes y sirve para indicar si el tamaño del fragmento de ADN que será clonado y seleccionado por el investigador es correcto, por ende, con amplia aplicación para la biología molecular. Según João Bosco, este insumo no era hasta ahora fabricado en Brasil.
Para posibilitar el desarrollo de nuevas moléculas, Proteobras ha contado, desde su creación, con recursos provenientes de organismos de fomento de la investigación. La primera financiación pública, obtenida en 2005, fue en el marco de un Pipe, por valor de 75 mil reales, cuyo objetivo consistía en establecer un protocolo de producción de la hormona folículo estimulante (FSH) bovina para su aplicación en casos de superovulación, una técnica que apunta al aumento y a la mejora del rebaño. En 2009, la empresa obtuvo una financiación por valor de 390 mil reales en el marco del Programa de Subvención Económica de la Financiadora de Estudios y Proyectos (Finep) para crear un protocolo de producción de algunas proteínas recombinantes y desarrollar estudios de caracterización de proteínas.
Con fuerte espíritu emprendedor, João Bosco Pesquero también colabora en el montaje de la empresa Exxtend, creada en octubre de este año mediante una asociación entre Proteobras y el grupo alemán K&A. El objetivo del nuevo emprendimiento consiste en ofrecer ciertos reactivos básicos denominados oligonucleótidos, muy utilizados por los investigadores en biología molecular y diagnósticos en el área de la salud. Sus principales usuarios son los laboratorios de investigación, clínicas médicas, hospitales, institutos de investigación y laboratorios privados. La empresa alemana, presente en 80 países, es la segunda productora del insumo a nivel mundial. Ella aportó la tecnología y suministró parte de los aparatos utilizados para la síntesis de los oligonucleótidos. “Actualmente no hay una empresa productora de oligos en el país, solamente representantes de grupos extranjeros. Estos reactivos se importan desde Europa, Estados Unidos y Asia, y tardan, en promedio, entre 15 y 20 días para llegar a las manos de los investigadores”. Exxtend ofrecerá el producto en pequeños frascos que se enviarán por correo en alrededor de dos días a sus clientes. De acuerdo con João Bosco, no existen datos precisos sobre el mercado de oligonucleótidos en Brasil, aunque las estimaciones apuntan que la demanda del reactivo será del orden de 200 mil a 300 mil unidades anuales. De comercializarse todo ese material, la empresa facturará 7 millones de reales, puesto que cada oligo cuesta alrededor de 25 reales. “Con Proteobras y Exxtend, pretendemos producir diversos insumos para la investigación en el país que actualmente sólo llegan importados”, dice João Bosco.
El proyecto
Desarrollo del kit diagnóstico de hipertensión por medio de marcadores moleculares involucrando a la enzima conversora de angiotensina e isoformas (nº 2009/51574-1); Modalidad Investigación Innovadora en Pequeñas Empresas (Pipe); Coordinador Paulo Roberto Pesquero – Proteobras; Inversión R$ 280.000,00 (FAPESP)
