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GENÉTICA

Una herramienta para editar el ADN

Un sistema inspirado en las bacterias, denominado CRISPR-Cas9, puede estimular descubrimientos en biología y medicina, aunque suscita temores éticos

ADN Edición 240Un sistema que les permite a las bacterias reconocer y combatir invasiones virales es una promesa de novedades significativas en el área de la genética. Se trata de una proteína guiada por una molécula de ARN que corta las cadenas del ADN en sitios específicos, y activa vías de reparación. En Brasil, ya hay varios científicos que se aprestan a incorporar en sus líneas de investigación esta técnica, cuya creación fue de 2012. Esto es algo que recién comienza y, por ahora, los resultados palpables son pocos. Pero es menester no perderlo de vista, tanto por lo prometedor del sistema como por su potencial para alterar genes humanos y producir bebés a medida, una cuestión que plantea reservas a punto tal de discutirse una moratoria sobre su uso.

“Se trata de un gran igualador, hasta nosotros podemos hacerlo”, bromea el médico José Xavier Neto, del Laboratorio Nacional de Biociencias (LNBio), con sede en Campinas, en refirencia al sistema que se hizo conocido como CRISPR-Cas9. Esta sigla significa Conjunto de Repeticiones Palindrómicas Cortas y Regularmente Espaciadas, que funciona junto a una proteína asociada llamada Cas. La CRISPR-Cas9 puede insertarse en células mediante el uso de virus o inoculando ADN en las etapas iniciales de un embrión. Una molécula de ARN que se sintetiza especialmente sirve como guía para llegar al gen que se pretende alterar (vea la infografía). Estos procedimientos se encuentran al alcance de la mayoría de los laboratorios de genética, lo cual les confiere autonomía a los investigadores.

En el laboratorio de Xavier Neto, todo comenzó con Ângela Saito, quien en esa época realizaba su doctorado bajo la dirección del biólogo Jörg Kobarg, en la Universidad de Campinas (Unicamp), y necesitaba contar con un roedor con deficiencia en la producción de una determinada proteína (ratón knockout) para el estudio de su rol en la leucemia. En los laboratorios de Xavier Neto, Saito comenzó con el tedioso proceso tradicional, cuando es necesario generar y rastrear las manipulaciones genéticas en cientos de clones de células madre embrionarias. Para aprender a realizar este trabajo a escala cuasi industrial, ella se trasladó ‒mientras hacía su doctorado‒ al Centro del Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas, donde pudo aprender la nueva técnica con el genetista estadounidense Richard Behringer. Luego regresó al laboratorio paulista y se trajo consigo los vectores que inocularía en los embriones de ratones para producir los knockout que necesitaba. Y tuvo éxito: Saito le enseñó la técnica a sus colegas y, en poco más de un año, el laboratorio produjo ratones knockout para cuatro genes diferentes.

Mutación del albinismo: para un efecto homogéneo, es necesario que se la inyecte al comienzo de la fase embrionaria

Carolina Clemente/ lnbioMutación del albinismo: para un efecto homogéneo, es necesario que se la inyecte al comienzo de la fase embrionariaCarolina Clemente/ lnbio

Para combatir enfermedades
El potencial de la CRISPR-Cas9 en la investigación de los agentes etiológicos de enfermedades también suscitó el interés de los parasitólogos venezolanos Noelia Lander y Miguel Chiurillo, que están interesados en el estudio del parásito Trypanosoma cruzi, causante de la enfermedad de Chagas, para contribuir, de ser posible, en el desarrollo de terapias alternativas. En la actualidad, Lander realiza una pasantía de posdoctorado en la Facultad de Ciencias Médicas de la Unicamp, en colaboración con los bioquímicos Aníbal Vercesi y Roberto Docampo, un argentino que se desempeña como docente en la Universidad de Georgia, en Estados Unidos, y es profesor visitante en la universidad del interior paulista. La investigadora ha demostrado que logra modificar genes en un artículo publicado en 2015 en la revista mBio. Lo hizo alterando genes ligados al flagelo de los parásitos, que es una estructura similar a una cola que les permite desplazarse. “Se trata de un fenotipo muy fácil de detectar, porque el flagelo se separa del cuerpo celular y el parásito queda en el fondo de la probeta”, explica. La prueba de concepto constituye un éxito, porque los tripanosomas se han mostrado muy eficaces para resistir a cualquier intento de manipulación genética. Ahora, en los estudios con genes implicados en la señalización celular por calcio, viene la etapa que podría ayudar en el combate contra esa enfermedad, para la cual se carece de un tratamiento eficaz en su fase crónica. “Los niveles de calcio se alteran bastante cuando el parásito infecta al huésped”, explica. “Si logramos manipular esas proteínas, que son diferentes entre el parásito y el huésped vertebrado, ese podría ser el camino hacia una terapia alternativa”.

El biólogo Jayme de Souza-Neto, del campus de Botucatu de la Universidade Estadual Paulista (Unesp) se ha propuesto combatir la transmisión del dengue. Ha comparado los ARN transcriptos de mosquitos Aedes aegypti infectados y resistentes al virus en poblaciones naturales de Botucatu, en el interior paulista, y Neópolis, en el estado de Sergipe, y ha identificado a los genes que podrían estar relacionados con esa resistencia. “Estamos comenzando a realizar las mutaciones en los genes de los mosquitos”, informa. Para el mes de julio, De Souza-Neto pretende disponer en el laboratorio de poblaciones en las cuales podrá verificar si la susceptibilidad al virus se alteró. En un horizonte lejano, la idea consiste en criar mosquitos resistentes, que, por no hallarse infectados, tampoco transmiten la enfermedad a los seres humanos. Este proyecto ha avanzado en el marco de una cooperación que se estableció entre la FAPESP, la Unesp y la Universidad de Keele, en el Reino Unido (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 230). El investigador trabajó durante tres meses en el laboratorio de Julien Pelletier, quien estuvo de visita en Botucatu durante cuatro meses. “En el mes de abril, Pelletier regresará y comenzaremos con las inoculaciones en los embriones de mosquitos”, planifica el De Souza-Neto.

La bióloga Natália Gonçalves opera con especies mayores: perros de la raza golden retriever que se emplean como modelo para el estudio de la distrofia muscular de Duchenne, una enfermedad degenerativa que termina por impedirles movilizarse y alimentarse (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 237). Durante su doctorado, la investigadora obtuvo linajes de células reprogramadas (células madre pluripotentes inducidas, o iPSCs, por sus siglas en inglés) a partir de células de la piel de los canes. Ahora, en su pasantía de posdoctorado bajo la supervisión de Carlos Eduardo Ambrósio, de la Facultad de Zootecnia e Ingeniería de Alimentos de la Universidad de São Paulo (FZEA-USP), se propone establecer un linaje con células de perros distróficos para rectificar el gen defectuoso y producir la proteína distrofina en un trabajo colaborativo con el genetista francés Jean-Paul Concordet, del Museo Nacional de Historia Natural, en París. “Ya conocemos cuál es el sector ausente del gen, y por eso la idea consiste en producir ese pedacito e insertarlo”, proyecta. Gonçalves una vasta labor por delante: mientras que la técnica para desactivar genes empleando CRISPR-Cas9 ya está razonablemente dominada, el éxito en la inserción de segmentos específicos todavía es escaso.

La genetista Maria Rita Passos Bueno, del Instituto de Biociencias de la USP (IB-USP), también apuesta a la alteración del ADN para el estudio de enfermedades humanas con la ayuda de la investigadora Erika Kague, quien aprendió esa técnica en el final de su pasantía de posdoctorado en la Universidad de Pensilvania, en Estados Unidos. El doctorando Luciano Abreu Brito produjo un linaje de pez cebra [Danio rerio] o zebrafish (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 209), para el estudio de la fisura labiopalatina. “Mediante secuenciación en pacientes, hallamos la mutación, y ahora podemos insertarla en el pez para analizar su importancia en relación con la enfermedad”, comenta. La doctoranda Danielle Moreira insertó mutaciones ligadas al autismo en células humanas aisladas. En un futuro, pretende valerse de iPSCs que puedan originar neuronas para comprobar si las alteraciones genéticas que identificó en pacientes modifican el funcionamiento de las células nerviosas.

La genetista Lygia da Veiga Pereira, del IB-USP, también está comenzando a modificar células humanas directamente. Su alumna de maestría, Juliana Sant’Ana se mantiene en contacto con el genetista Chad Cowan, de la Universidad Harvard, en Estados Unidos, para capacitarse en la utilización del CRISPR-Cas9. Su plan consiste en provocar en el gen de la glucoproteína denominada fibrilina una mutación típica del síndrome de Marfan. Cuando lo logre con células de fácil cultivo, Veiga Pereira se propone pasar al linaje de células madre que desarrolla en su laboratorio, el BR-1 (lea en Pesquisa FAPESP, edición nº 153). “Mi idea es producir células cardíacas y células óseas con esa mutación”, planea. La facilidad de trabajo con el CRISPR-Cas9 permite sortear esa etapa con relativa rapidez y llegar a lo que realmente interesa: el estudio del comportamiento de la enfermedad en diferentes tejidos. “La ciencia comenzará cuando podamos comparar esas células”.

Crispr_bebesFundoCAETOEstructura proteica
La genetista Passos Bueno explica que el conocimiento sobre el sistema CRISPR-Cas9 está avanzando velozmente en la búsqueda de una exactitud cada vez mayor en la edición. Actualmente, una de las vertientes que investiga Jennifer Doudna, de la Universidad de California, en Berkeley, una de las protagonistas del desarrollo de la técnica, consiste en dilucidar cómo la estructura de la proteína permite que la misma pueda insertarse en el ADN y lo corte en un punto específico, tal como revela un artículo que se publicó en enero en la revista Science.

El bioquímico germanochileno Martin Würtele, de la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp), ya se dedicaba a develar la estructura tridimensional de esas proteínas incluso antes del descubrimiento de Doudna y su colega francesa Emmanuelle Charpentier, del Instituto Max Planck de Biología de la Infección, de Alemania, en 2012. “Comenzamos a trabajar hace unos cinco años con diversas proteínas CRISPR/Cas debido a su aporte a la protección de las bacterias contra sus principales enemigos naturales, los bacteriófagos, como así también por la posibilidad de efectuar edición en el ADN”, relata. “Pero, de ahí en más, descubrieron la Cas9, que, al contrario de los sistemas CRISPR-Cas con los que trabajábamos, realiza todo el proceso con una única proteína y es un candidato serio a la obtención del Premio Nobel”. Würtele reveló que una proteína denominada Csm2, que se extrae de una bacteria, está formada por una extensa cadena de aminoácidos en hélice, circundada por tres hélices más cortas. “La proteína Csm2 es completamente diferente a las descritas en otros complejos”, comenta el investigador. A su juicio, esa proteína forma parte de una defensa importante de la bacteria y el conocimiento de cómo funciona podría utilizarse contra las propias bacterias. “Existe un gran interés en el uso de bacteriófagos como sustitutos potenciales de los antibióticos”.

Las aplicaciones son tantas que la posibilidad de edición de genes humanos genera temores. Por ahora, la continuidad de las investigaciones está asegurada, con la propuesta de prohibir la implantación de embriones humanos alterados. Muchos científicos se muestran preocupados, pero José Xavier Neto no lo considera un riesgo real. “Los males de rebasar la evolución podrían resultar mucho mayores que los beneficios”, advierte. “La posibilidad de que aparezcan efectos off target [no previstos] podría derivar en que falle lo conocido y ocurra lo que no se previó, generando bebés ‘programados’ para lograr una apariencia o un determinado desempeño, pero con leucemia o problemas peores”. Para evitarlo, existen mecanismos de control tales como comités de ética y, en Brasil, la Ley de Bioseguridad, que prohíbe la ingeniería genética en embriones humanos. Por su parte, el Reino Unido ya lo ha decidido: el 1º de febrero autorizó la edición genética en células humanas en el ámbito de la investigación científica.

Proyectos
1.
Generación de ratones knockout para el receptor nuclear huérfano Coup-TFII: Investigación de los mecanismos moleculares que determinan la expresión atrial específica del promotor del gen SMyHC3 (nº 2015/10166-9); Modalidad Beca en Brasil – Posdoctorado; Investigador responsable José Xavier Neto (CNPEM); Becaria Ângela Saito (CNPEM); InversiónR$ 169.558
2. Señalización por iones de calcio en tripanosomátidos (nº 2013/50624-0); Modalidad Apoyo a la Investigación – Programa SPEC; Investigador responsable Roberto Docampo (Unicamp); Inversión R$ 1.955.088
3. Edición génica por CRISPR-Cas9 en la corrección de la Distrofia Muscular de Duchenne en el modelo canino (GRMD) a partir de células de pluripotencia inducidas (nº 2015/09575-1); Modalidad Beca en Brasil – Posdoctorado; Investigador responsable Carlos Eduardo Ambrósio (USP); Becaria Natalia Juliana Nardelli Gonçalves (USP); InversiónR$ 169.558
4. Caracterización de los mecanismos de acción antidengue por medio de la microbiota intestinal de poblaciones naturales del mosquito Aedes aegypti (nº 2013/11343-6) Modalidad Apoyo a la Investigación – Jóvenes Investigadores; Investigador responsable Jayme Augusto de Souza-Neto (Unesp); Inversión R$ 2.209.619,50
5. Generación de mutaciones en el gen FBN1 en Células Madre Pluripotentes Inducidas (iPSCs) utilizando el sistema CRISPR-Cas9 (nº 2015/01339-7); Modalidad Beca en Brasil – Maestría/ Capes; Investigadora responsable Lygia da Veiga Pereira Carramaschi (USP); Becaria Juliana Borsoi Sant’Ana (USP); InversiónR$ 38.823,80
6. Análisis genómico para la comprensión de los mecanismos genéticos etiológicos de las fisuras labiopalatinas en la población brasileña (nº 2011/23416-2); Modalidad Beca en Brasil – Doctorado; Investigadora responsable Maria Rita dos Santos e Passos Bueno (USP); Becario Luciano Abreu Brito (USP); InversiónR$ 146.770,80
7. Biología estructural de proteínas procesadoras de ácidos nucleicos en bacterias con elevada importancia biomédica (nº 2011/50963-4); Modalidad Apoyo a la Investigación – Regular; Investigador responsable Martin Rodrigo Alejandro Würtele Alfonso (Unifesp); Inversión R$ 496.766

Artículos científicos
JIANG, F. et al. Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. Science. Online. 14 ene. 2016.
LANDER, N. et al. CRISPR-Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. v. 6, n. 4, e01012-15. jul-ago. 2015.
GALLO, G. et al. Structural basis for dimer formation of the CRISPR-associated protein Csm2 of Thermotoga maritima. FEBS Journal. Online. 10 dic. 2015.
GALLO, G. et al. Purification, crystallization, crystallographic analysis and phasing of the CRISPR-associated protein Csm2 from Thermotoga maritima. Structural Biology Communications. F71, p. 1223-27. oct. 2015.